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Pruebas Descripción y Resultados

Prueba	Descripción	Resultado
Agar MacConckey	Es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen. La hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo. Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio tira a amarillo por la subida de pH que origina la utilización de las proteínas (peptona) del medio Se inoculan placas del medio y se incuban a 37 oC	Positivo Negativo Sin crecimiento
Agar sangre	Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematíes. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematíes. Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba	Hemolisis alfa Hemolisis beta Hemolisis gamma Sin crecimiento Sin resultados
Betagalactosidasa	Esta enzima hidroliza la lactosa originando glucosa y galactosa Se añade un sustrato artificial ortocitrofenial galactósido (ONPG) que hidrolizado por la ß-galatosidasa originándose en color amarillo	Positivo Negativo
Catalasa	La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es útil para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva) La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.	Positivo Negativo
Citrato	Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el ácido y como consecuencia se produce un incremento de pH en el medio y el indicador tira de verde a azul. El citrato es la única fuente de carbono y se realiza sembrando la bacteria en la superficie de un agar de Simmon's inclinando el tubo	Positivo Negativo
Coagulasa	La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción positiva y los no patógenos negativa Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.	Positivo Negativo
Contraste de fases	El microscopio de contraste de fases es un sistema en el que se acentúa la diferencia del índice de refracción entre las células y el medio incrementando así el contraste en células translúcidas sin uso de colorantes.	Bacilos Cocos
Descarboxilasa de aminoácidos	Los aminoácidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol)	Positivo Negativo
DNasa	Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.	Positivo Negativo
Esporas (calentamiento)	Las Endosporas son formadas por Bacillus y Clostridium. Son Formas de resistencia, metabolicamente inactivas que resisten la alta temperatura, la desecación y la radiación. Las endosporas pueden sobrevivir al calentamiento y originan nuevas formas vegetativas en un medio de cultivo. Se inocula un tubo de caldo con una suspensión sospechosa de contener endosporas. Se calienta a 80 oC durante 10 min. Se enfría y se incuba a temperatura adecuada.	Positivo Negativo
Fenilalanina desaminasa	Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico Se inoculan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico.	Positivo Negativo
Fermentación de azucares	Las bacterias anaerobias o anaeróbicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azúcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas. Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.	Acido Acido + gas Negativo Sin ácido
Gram	La tinción de Gram es la más importante de las tinciones diferenciales. Las células Gram positivas retienen el cristal violeta cuando se tratan con etanol mientras que las gram negativas no lo tienen y se tiñen entonces del color rojo de la safranina. Diferencias en la estructura de la pared son las responsables de este comportamiento. Se tiñe con cristal violeta Se trata con lugol como mordiente Se decolora con etanol 96o Se añade safranina como colorante de contraste	Bacilos Gram-negativos Bacilos Gram-positivos Cocos Gram-positivos Cocos Gram-negativos
Hidrólisis de Esculina	La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.	Positivo Negativo
Hidrólisis de gelatina	La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.	Positivo Negativo
Hidrólisis de lípidos	Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lípidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento. Una emulsión de lípidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio sólido complejo.	Positivo Negativo
Hidrólisis del almidón	Los polisacáridos, como el almidón son demasiados largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligo o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer. La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.	Positivo Negativo
Hidrólisis del hipurato	El hipurato es un compuesto orgánico aromático que puede ser hidrolizado enzimáticamente originando benzoato y glicina. Este test se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus. Una suspensión de bacterias se añade a una solución de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se añade la nihidrina.	Positivo Negativo
Indol	Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias. Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptona). La presencia de indol se ensaya añadiendo dimetilaminobenzaldehído.	Positivo Negativo
Inhibición por KCN	El KCN inhibe la cadena de transporte de electrones uniéndose a los citocromos impidiendo el crecimiento microbiano. Sin embargo, algunas bacterias no son inactivadas y pueden nacer. Las bacterias se inoculan en caldo de peptona que contiene cianuro potásico.	Sensible Resistente
Motilidad	La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparación en fresco con el microscopio de contraste de fase Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco que se observa en contraste de fases. La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación.	Movil Inmovil
O-F (oxidación -fermentación)	En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxígeno es el aceptor final de e- en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaeróbicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido que se detecta gracias al azul de bromotimol (indicador de pH) Es útil en la distinción de pseudomonas y enterobacterias. Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación)	Fermentativo Oxidativo Negativo
Oxidasa	La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo) Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo.	Positivo Negativo
Producción de sulfhídrico	Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato. La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.	Positivo Negativo
Reducción de nitrato	Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno). Las enterobacterias y pseudomonas son usualmente positivos. Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a más que a nitritos produciéndose gas. Si al añadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación)	Positivo Negativo
Rojo de metilo	Es uno de los test del IMVIC para bacterias entéricas. Algunas vías fermentativas originan ácidos orgánicos mientras otras originan productos que son neutros. Las bacterias se crecen en caldo de glucosaçpeptona. Si se fermenta el azúcar el pH baja por debajo de 4.3. Se añade rojo de metilo como indicar que es rojo a pH <4.3. y amarillo a pH >4.3.	Positivo Negativo
Tioglicolato	Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Un tubo con medio semisólido contiene Tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del tubo. Un indicador redox, resazurina, indica si hay oxígeno (rojo) o no (incoloro). El tubo es inoculado con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su crecimiento.	Aerobio Anaerobio Facultativo Microaerobio
Ureasa	Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador. Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol	Positivo Negativo
Utilización Fuentes de Carbono	La mayoría, pero no todas las bacterias pueden crecer en medios simples con una única fuente de carbono. Este método permite ensayar tal habilidad y la capacidad para utilizar sustratos específicos. Las bacterias se inoculan en medios simples conteniendo diferentes sustratos orgánicos como fuentes de carbono y energía.	Positivo Negativo
Voges- Proskauer	Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a caso fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa aumenta acetoína en el medio. Se añade alfanaftol en medio alcalino (KOH). La acetoína se convierte en diacetilo que reacciona formándose un color rojo	Positivo Negativo

BACTERIAS

Prácticas de microbiología clínica

Quimioterápicos_Antibiograma

DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DE LAS

BACTERIAS A LOS ANTIBIÓTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCIÓN

La resistencia de las bacterias es el principal obstáculo para la eficacia terapéutica de los antibióticos, pues no sólo puede anular la acción curativa si se manifiesta en el curso del tratamiento, sino que tiene a la larga consecuencias todavía más graves para el conjunto de la población, ya que provoca la desaparición de las cepas susceptibles y la propagación de las resistentes.

Ese es el motivo por el cual la determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos haya adquirido tanta importancia y sea indispensable para hacer de los antibióticos un uso racional y para preservar la eficacia de este grupo tan valioso de agentes terapéuticos.

El conocimiento de la sensibilidad a los antibióticos del microorganismo causante de una enfermedad, no es sólo importante para hacer la selección inicial del agente terapéutico correspondiente, sino que además en aquellos casos en los cuales el paciente presente intolerancia a determinado fármaco, permite seleccionar el más adecuado para ese paciente en particular.

Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas. La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clínico algunas recomendaciones sobre la terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una infección específica.

No obstante, la correlación exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clínica es muchas veces difícil de predecir, ya que existen numerosos factores que influencian la interacción de los agentes antimicrobianos y los microorganismos en un determinado paciente. Entre los factores podemos resaltar:

• Factores del agente antimicrobiano

o Farmacocinética

o Unión a proteínas del plasma

o Vías de administración

o Acción bacteriostática o bactericida

o Concentración en el sitio de la infección

• Factores del huésped

o Enfermedad

o Estado inmunológico

o Formación de absceso

o Presencia de cuerpo extraño

o Función renal y hepática

o Cumplimiento del tratamiento

• Factores del microorganismo

o Virulencia

o Alta concentración de microorganismos

o Infección mixta

o Desarrollo de resistencia durante el tratamiento

La metodología usada para realizar el antibiograma toma en consideración algunos de estos factores para determinar más eficientemente cómo un microorganismo podría responder in vivo a un determinado antibiótico.

Existen diversos métodos para determinar la sensibilidad bacteriana a los antibióticos, presentando además cada uno de estos métodos, múltiples variantes.

Cualquiera que sea el método seleccionado, el medio de cultivo a emplear ha de ser aquel que permita un buen desarrollo del microorganismo cuya sensibilidad se determina y además no debe ejercer ningún efecto inhibidor sobre la actividad antibacteriana de los antibióticos o quimioterápicos ensayados.

Usualmente se utiliza el agar de Mueller-Hinton en las pruebas de sensibilidad

de microorganismos aeróbicos de rápido crecimiento.

Cuando se trata de estreptococos u otros microorganismos exigentes, se le añade al Mueller-Hinton, 5% de sangre desfibrinada.

De los métodos existentes, el más popular es el del disco de papel. La variante más utilizada de este método es la de Kirby Bauer, la cual consiste en utilizar una sola concentración de antibiótico y medir el tamaño de la zona de inhibición.

OBJETIVO

Realizar un ensayo de sensibilidad de un cultivo bacteriano a los antibióticos,

usando el método de Kirby Bauer. Interpretar los resultados y hacer el informe

correspondiente.

FUNDAMENTO

En el método de Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico.

Las placas se incuban por 16-18 horas a 35-37°C.

Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a

través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se

aleja del disco. En un punto determinado, la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas publicadas por los organismos encargados del control de tales métodos, por ejemplo el Comité Nacional de Estándar de Laboratorios Clínicos de los Estados Unidos de Norteamérica (National Committee for Clinical Laboratories Standards).

PROCEDIMIENTO

Para obtener resultados confiables y reproducibles mediante este método, es

imprescindible seguir fielmente las instrucciones que daremos a continuación:

1. Funda el medio de cultivo y déjelo enfriar a 45-50°C.

2. Vierta asépticamente suficiente cantidad de medio de cultivo en una placa

de Petri, para obtener una capa de 4 mm de espesor. Para una placa de 10 cm. de diámetro se requieren 30 mL de medio y para una de 15 cm se requieren 70 ml.

3. Deje solidificar el medio de cultivo y luego seque las placas durante 30 minutos antes de usarlas para la inoculación.

4. Inocule la placa mediante un hisopo estéril utilizando una suspensión del germen de 18 a 24 horas de incubación con una turbidez equivalente a 1,5 x 106 bacterias (Equivale al tubo No. 5 de la escala de Mc Farland). Para la inoculación sumerja un hisopo estéril en el cultivo y elimine el exceso rotándolo firmemente contra la pared interna del tubo. Frote el hisopo sobre la superficie del medio de cultivo.

5. Repita esta operación por tres veces sucesivas, rotando la placa para obtener una dispersión uniforme del inóculo en toda la superficie.

6. Coloque la tapa a la placa y deje secar el inóculo por 3 a 5 minutos.

7. Coloque los discos con los antibióticos sobre el agar mediante pinzas estériles o usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con una pinza para asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los discos deben estar espaciados de manera que su distancia a la pared de la placa sea de 15 mm y entre ellos de 30 mm.

8. Incube a 35 – 37°C hasta el siguiente día (aproximadamente 18-19 horas).

CRITERIOS DE INTERPRETACIÓN BASADOS EN MÉTODO DE KIRBY-BAUER DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD PARA MICROORGANISMOS DE FÁCIL CRECIMIENTO 

Agente Antimicrobiano	Contenido del disco		Diámetro de la zona de inhibición en mm
			Resistente < ó =12	Intermedio 13-17	Sensible > ó =18
BETALACTÁMICOS, PENICILINAS
Ampicilina (AMN) Enterobacteriaceae Estafilococos Enterococos Estreptococos β hemolíticos	10 µg 10 µg 10 µg 10 µg		13 28 16 18	14-16 ....... ....... 19–25	17 29 17 26
Oxacilina (OXA) Estafilococos coagulasa negativo S.aureus Neumococos para evaluar sensibilidad a penicilina	1 µg 1 µg 1 µg		17 10 .........	......... 11-12 .........	18 13 20
Penicilina G (PEN) Estafilococos Enterococos Estreptococos β hemolíticos	10 U 10 U 10 U		28 14 19	......... .......... 20–27	29 15 28
BETALACTÁMICOS COMBINADOS CON INHIBIDORES B-LACTAMASA
Amoxicilina / Acido Clavulánico (AMC) Estafilococos Enterobacteriaceae		20/10 µg 20/10 µg	19 13	........ 14–17	20 18
Ampicilina / Sulbactama (AMS)		10/10 µg	11	12-14	15
Piperacilina / Tazobactama (TAZ) Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Esfafilococos meticilina S		100/10 µg 100/10 µg 100/10 µg	17 17 17	18-20 ......... .........	21 18 18
CEFALOSPORINAS
Cefaclor		30 µg	14	15-17	18
Cefazolina		30 µg	14	15-17	18
Cefepime(FEP)		30 µg	14	15-17	18
Cefixima		5 µg	15	16-18	19
Cefoperazona		75 µg	15	16-20	21
Cefotaxima		30 µg	14	15-22	23
Cefoxitina (CXT – FOX)		30 µg	14	15-17	18
Ceftacidima (CAZ)		30 µg	14	15-17	18
Ceftixozima		30 µg	14	15-19	20
Ceftriaxona (CTX)		30 µg	13	14-20	21
Cefuroxima sódica parenteral		30 µg	14	15-17	18
Cefalotina (CEF)		30 µg	14	15-17	18

CARBAPENEMES
Imipenem (IMP)			10 µg			13			14-15			16
Meropenem (MER)			10 µg			13			14-15			16
MONOBACTAMAS
Aztreonam (AZT)			30 µg		15			16-21			22
GLICOPÉPTIDOS
Teicoplanina (TEI)			30 µg		10			11-13			14
Vancomicina (VAN) Enterococos Estafilococos			30 µg 30 µg		14 ........			15-16 ..........			17 15
AMINOGLUCÓSIDOS
Amicacina (AMK)			30 µg		14			15-16			17
Gentamicina (GEN)			10 µg		12			13-14			15
Kanamicina			30 µg		13			14-17			18
MACRÓLIDOS
Azitromicina			15 µg		13			14-17			18
Claritromicina			15 µg		13			14-17			18
Eritromicina (ERY)			15 µg		13			14-22			23
	TETRACICLINAS
	Minociclina (MIN)	30 µg		14			15-18			19
	Tetraciclina (TET)	30 µg		14			15-18			19
	QUINOLONAS
	Ciprofloxacina (CIP)	5 µg		15			16-20			21
	Levofloxacina	5 µg		13			14-16			17
	Nalidixico Ácido (NAL)	30 µg		13			14-18			19
	Norfloxacina (NOR)	10 µg		12			13-16			17
	Ofloxacina (OFL)	5 µg		12			13-15			16
	Trovafloxacina	10 µg		13			14-16			17
	OTROS ANTIMICROBIANOS
	Cloranfenicol (CMP – CHL)	30 µg		12			13-17			18
	Clindamicina (CLI)	2 µg		14			15-20			21
	Fosfomicina Trometamol	200 µg		12			13-15			16
	Nitrofurantoína (NIT)	300 µg		14			15-16			17
	Rifampicina (RIF)	5 µg		16			17-19			20
	Sulfonamidas	300 µg		12			13-16			17
	Trimetoprima/Sulfametoxazol (TMS)	1.25/23.75 µg		10			11-15			16

PARA LOS SIGUIENTES ANTIMICROBIANOS QUE NO FIGURAN EN LAS NORMAS N.C.C.L.S. (2000) SE HAN CONSULTADO INFORMES DE OTRAS SOCIEDADES CIENTIFICAS Y PUBLICACIONES DE INVESTIGADORES ARGENTINOS Y EXTRANJEROS
Cefoperazona/Sulbactama (CFS)	75/30 µg	15	16-20	21
Colistina (COL)	10 µg	8	9-10	11
Fosfomicina	50 µg	12	13-17	18
Fusídico Ácido (FUS)	10 µg	15	16-21	22
Neomicina (NEO)	30 µg	12	13-16	17
Polimixina B (POL)	300 U	8	9-11	12