Medios. Tinciones

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:         a) Su consistencia       b) Su utilización         c) Su composición d) Su origen SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA). 1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. 2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licua a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble en agua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos. 3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias SEGÚN SU UTILIZACIÓN. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores  indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. 6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto último los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos. 7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios. 8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:   a) haciendo pases periódicos de placa a placa,   b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y   c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc. ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN. Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados. 2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida. 3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc. Según su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente. b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) SEMISINTÉTICOS: son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.  DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO  MEDIOS DE CULTIVO COMUNES. Son los más corrientemente utilizados, y aunque no voy a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología. Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial. Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja.  La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable.  El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha añadido una mezcla de tres antibióticos específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante.  Agar MacConkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los gérmenes que fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja). Agar C.L.E.D: (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado. Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen. Agar Hektoen: Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien en este medio. C.P.S. ID3: Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualización del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej) Granada: Medios utilizados para detección de Streptococcus agalactiae, mediante la utilización de un sustrato cromogénico específico de este microorganismo. Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio. Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegérmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas). Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto. Medio de Loeffler: Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium difteriae. Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez. Agar Kligler: Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos conmás detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sódico. Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas. Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias.El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV. Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios. Agar Gardnerella: Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia. Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract): Se utiliza para el aislamiento de bacterias del género Legionella Löwenstein-Jensen: Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita parainhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.

Tinciones.

El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especimenes teñidos.

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparación de forma rápida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación química, ya que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los microorganismos.

Algunos colorantes precipitan y se disuelven en componentes celulares, como el negro de Sudan que es liposoluble y permite distinguir los glóbulos de grasa.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite la observación del movimiento de los microorganismos. Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el microorganismo, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:
- Preparación húmeda. 

Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente.
-  Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión.

Tinciones
Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.

Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
- Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
- Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
- Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen.
Ejemplo: Negro sudán.

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.
- Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un  colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina).
- Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.

- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.

  Tipos de colorantes:

Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ión cargado positivamente, mientras que en los ácidos, el colorante es el ión cargado negativamente. Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión.

Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno.

Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

La aplicación de diferentes colorantes según sus propiedades y las combinaciones de colorantes, mordientes y decolorantes, han permitido desarrollar tinciones que puedan agruparse en;

Tinciones simples

Tinciones  diferenciales

Tinciones selectivas.

Las Tinciones simples: consisten en aplicar un solo colorante a la preparación para observar la morfología de los microorganismos. Se usan principalmente colorantes básicos como el azul de metileno, cristal violeta o safranina, fuchina diluida, violeta de genciana.

Las Tinciones diferenciales: consisten  en aplicar una combinación de colorantes, mordientes y decolorantes que permitan poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición de los microorganismos. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que aun cuando teniendo igual morfología, presentan diferencias en su composición química. Las dos tinciones diferenciales  mas importantes que se aplican en bacteriología son:

Gram 

Preparación del frotis:

 La extensión del material sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, en función de la procedencia del producto a examinar.

 Si el producto es líquido, se depositará una pequeña cantidad de material en el centro del porta, extendiéndolo con el asa hasta conseguir una capa fina y homogénea.

 Si la extensión debe hacerse a partir de un cultivo en medio sólido, la colonia que vayamos a estudiar se mezclará con una gotita de agua destilada estéril colocada en el centro del porta.

Se hace el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra.

Dejar secar.

 Suero fisiológico:

                                                ClNa  9 g.

                              Añadir H2O  y enrasar hasta 1OOO ml

Las Tinciones selectivas: Son aquellas que permiten observar un orgánulo celular 

Ziehl-Neelsen

Fundamento: Se utiliza para objetivar la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en una muestra o preparación y como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes (BAAR).

Material:

Microscopio, portaobjetos, asa de siembra, cubeta de tinción, frasco lavador, papel de filtro, mechero de alcohol

Reactivos:

Microorganismo

Agua destilada.

Fucsina fenicada.

Alcohol clorhídrico

Azul de metileno

Técnica

Verter sobre el frotis previamente fijado, de 10 a 15 gotas de fucsina.fenicada

Calentar hasta emisión de vapores. Repetir 1 a 4 veces el mismo procedimiento.

Decolorar con alcohol-ácido (alcohol clorhídrico).

Lavar con agua.

Teñir con azul de metileno, durante un minuto.

Lavar con agua y dejar secar.

Examinar al microscopio con objetivo de inmersión.

Método:

Utiliza: coloración inicial, decoloración y adición de un colorante de contraste.

Tras la preparación del frotis, secado y fijación se procede como sigue:

1. Cubrir la preparación totalmente con fucsina fenicada

2. Calentar la preparación hasta la emisión de vapores tres veces, dejando que se enfríe.

3. Lavar y decolorar con alcohol-ácido.

4. Lavar y cubrir con azul de metileno durante unos minutos.

5. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.

Resultados: Las bacterias ácido alcohol resistentes quedan teñidas de rojo y las que no lo son, de azul.

Alcohol-ácido:

                        Alcohol     970 ml

                        Cl H     30 ml