Coprocultivo:protocolo de rutina

Estudio microbiológico de las heces. Coprocultivo 

INTRODUCCION

Las afecciones gastrointestinales de etiología microbiana pueden estar producidas por una gran variedad de protistas, ya sea directamente por sí mismos, que al penetrar en el intestino en una determinada proporción establecen cambios ecológicos importantes, desplazando a la flora autóctona allí existente, o indirectamente, por la secreción de diversos fermentos y toxinas que alteran la motilidad y permeabilidad de la membrana intestinal.

El primer caso podemos definirlo como infección intestinal, y el segundo –dependiendo de si la elaboración del producto metabólico del microorganismo se hace antes o después de su ingestión por el paciente– se llamará respectivamente, intoxicación alimentaria o toxiinfección.

Los productos intestinales de una persona sana incluyen un gran número de microorganismos saprófitos, que fabrican entre sus productos metabólicos una variada cantidad de sustancias vitamínicas, que son fácilmente aprovechadas por el hospedador.

Estas bacterias ocupan principalmente el colon y la parte terminal del íleon, representando, según distintos autores, entre 1/3 y 1/8 del peso seco de las heces. Esta variación cuali y cuantitativa está condicionada por la edad y por el régimen alimenticio seguido.

En el niño mayor y en el adulto, los anaerobios, que presentan ambas coloraciones frente al método de Gram, son aún el tipo predominante; entre los aerobios la proporción aproximada es la siguiente:

– E. coli y coliformes: 80 por 100.
– Enterococos: 14 por 100.
– Staphylococcus y Streptococcus : 4 por 100.
– Proteus : 1 por 100. 
– Otros: 1 por 100.

Al igual que en el lactante, la dieta alimenticia varía la composición de la flora intestinal del adulto; así, si la nutrición se hace principalmente con proteínas, aumenta la flora gramnegativa, y cuando predominan los hidratos de carbono se favorece la presencia de la grampositiva.

Entre los principales patógenos intestinales podemos considerar a los siguientes:

– Virus: Rotavirus, Enterovirus, Parvo-Picornavirus, Astrovirus, Coronavirus.

–Protozoos: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia. 

–Levaduras: Candida albicans.

– Bacterias: Salmonella sp., Shigella sp., Vibrio cholerae, Vibrio El Tor, Vibrio NAG, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli enteropatógeno, Campylobacter, Pseudomonas, Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, y otros menos frecuentes como Mycobacterium tuberculosis, etc.

Al igual que en el caso de otras muestras humanas, sería conveniente que el clínico orientase al laboratorio sobre el proceso de infección y la etiología sospechosa.
Es preciso recordar que las intoxicaciones alimentarias, es decir, las debidas a toxinas producidas fuera del hospedador y después ingeridas, generalmente no cursan con fiebre y tienen un período de incubación muy corto; en cambio, las producidas directamente por microorganismos cursan habitualmente con fiebre y tardan más en aparecer.

RELACION ENTRE ALGUNOS TIPOS DE GASTROENTERITIS
Microorganismos	Patología causada por (2)	Período de incubación (3)	Síntomas comunes (4)
Staphylococcus aureus.	Toxina (termoestable).	2-6 horas.	Náuseas, vómitos, calambres abdominales, diarrea (30 %).
Salmonella.	Infección	12-36 horas.	Diarrea, dolor abdominal.
Shigella	Infección	24-72 horas.	Diarrea líquida con mucus.
Clostridium perfringens.	Toxina (moderadamente termoestable)	6-12 horas.	Diarrea, calambres.
Clostridium botulinum.	Toxina (termoestable)	Variable (de horas a días)	Gastroenteritis inicial seguida por efectos de tipo curare.
(1) La tabla describe algunos microorganismos productores de gastroenteritis. (2) Patología causada por la producción de toxinas o por enteroinvasividad. (3) El efecto patológico se manifiesta generalmente antes si el microorganismo produce toxinas. (4) Entre los síntomas de gastroenteritis figura siempre la diarrea y sólo en los casos de infección es habitual la fiebre.

OBTENCION DE LA MUESTRA

La obtención de la muestra se hará depositando directamente la misma en un recipiente estéril, frasco de boca ancha. En caso de no ser posible esta toma directa, se recogerá con una cuchara estéril alguna porción del material fecal recién emitido, que no haya entrado en contacto con el frasco receptor (orinal), y se verterá en un contenedor estéril.

El producto así recogido se debe sembrar inmediatamente. En caso de no poder sembrar la muestra «in situ», y ante la necesidad de mandarla a un laboratorio, aunque esté relativamente cercano, es conveniente enviar parte de ella, incluida en algún medio de transporte que mantenga el pH cercano a la neutralidad.
Medio de transporte de Cary-Blair. Es quizá el más aceptado universalmente. Permite incluso la recuperación de anaerobios.

METODOLOGIA 

Observación de la muestra

Al recibir la muestra en el laboratorio se observarán detenidamente sus características, tales como el olor, color, consistencia, o la presencia de mucosidades, sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles pueden orientar algo el diagnóstico; así, por ejemplo, unas heces líquidas con grumos en forma de agua de arroz, harán pensar en el cólera, o la sangre y mucosidades indicarán una sintomatología inflamatoria del intestino, que puede ser debida a una disentería.

Hay autores que completan esta apreciación microscópica, mezclando en un porta una pequeña porción de heces con una gota de azul de metileno, tapándolo con un cubre y observando la preparación con objetivo de inmersión, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotará que hay inflamación en el intestino, la cual suele estar producida por agentes infecciosos invasores como Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en cambio, ante un proceso gastroenterítico, con heces exentas de glóbulos blancos, se sospecha una etiología virásica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli enterotóxico. Incluso hay investigadores que afinan más, y con una técnica de coloración como la de Wright, llegan a establecer las distinciones etiológicas expuestas en la siguiente tabla.

ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES ASOCIADAS CON LEUCOCITOS FECALES
Enfermedad	Porcentaje de pacientes con leucocitosis fecal (1)	Tipo de leucocito predominante (2)
Shigelosis	100	Leucocitos polimorfonucleares (media 84 %).
Salmonelosis (no por S. typhi)	82	Leucocitos polimorfonucleares (media 75 %).
Fiebre tifoidea	100	Leucocitos mononucleares (media 95 %)
E. coli (invasor)	100	Leucocitos polimorfonucleares (media 85 %).
Colitis ulcerosa (activa)	100	Leucocitos polimorfonucleares (media 88%) (eosinófilos, media 8 %).
Disentería amebiana (activa)	Variable	Por lo general mononucleares, salvo infección bacteriana secundaria
Controles sanos, diarrea virásica, cólera.	0-10
(1) La leucocitosis fecal se puede apreciar, simplemente, por observación entre porta y cubre. (2) El tipo de leucocitos se observa después de una coloración de Gram.

Conviene recordar la poca utilidad de las coloraciones diferenciales directas (Gram), sobre el material fecal. En caso de tenerlo, su valor queda restringido al diagnóstico de afecciones levaduriformes del género Candida , o al de infecciones estafilocócicas, que sobrevienen después de largos tratamientos con antibióticos de amplio espectro.

No son del todo valorables los resultados obtenidos con técnicas de inmunofluorescencia, pues los distintos géneros de Enterobacteriaceae presentan bastantes antígenos comunes.
Estudio de los distintos patógenos
Los microorganismos citados como patógenos se pueden separar en cuatro grupos muy diferenciados desde el punto de vista morfológico: virus, protozoos, levaduras y bacterias.

Virus : De las técnicas de diagnóstico virológico, sólo están al alcance de la mayoría de los laboratorios, las indirectas, es decir, las serológicas y aun no todas; las directas están reservadas a laboratorios altamente especializados. Entre las primeras podemos citar las de inmunofluorescencia indirecta, ELISA, y fijación de complemento. Entre las directas, los cultivos en líneas celulares y sobre todo la observación al microscopio electrónico (ME). Esta última permite con un máximo de eficacia, entre el segundo y tercer día de establecida la gastroenteritis, detectar el número, estado y frecuencia de los virus.

El principal agente virásico productor de infecciones gastrointestinales es el Rotavirus. actualmente se puede hacers por microscopía de fluorescencia.  Es una técnica utilizada en casos muy concretos, en los que además se quiere investigar la presencia de otros microorganismos raros o difíciles, los laboratorios deberán seleccionar estas muestras y enviarlas a laboratorios especializados, o a los de referencia como el Centro Nacional de Microbiología de Majadahonda. La forma correcta de hacerlo sería mandar unos 10 g. de material fecal en recipiente estéril y protegidos a 4° C.

Protozoos : Igual que para el estudio bacteriológico, las muestras han de ser recientes y se deben procesar recién llegadas al laboratorio. En el caso de no poderlas estudiar en seguida, se les añadirá alguna sustancia que mantenga la morfología de las formas trofozoicas. Para este propósito es útil el alcohol polivinílico. Un estudio parasitológico incluye tres tipos de técnicas:

a) Observación en fresco con lugol para quistes, o con solución salina para trofozoitos.

b) Coloraciones (hematoxilina férrica, etcétera). 

c) Concentración de quistes.

Levaduras : Las levaduras, por sus características de cultivo y propiedades fisiológicas, se incluyen dentro de la sistemática de estudio de las bacterias.

Bacterias : Las bacterias son, si no el grupo más numeroso de agentes etiológicos de gastroenteritis, por lo menos el más conocido.

Para su reconocimiento no se precisan técnicas tan especializadas como para los virus, ni la observación morfológica como para los protozoos, sino el crecimiento en medios de cultivo, y una posterior identificación por medio de pruebas bioquímicas, serológicas.

Siembra de muestras para bacteriología

Para hacer el coprocultivo, es decir, la siembra de las muestras fecales, se recogerán aquellas partes del contenido intestinal que llamen más la atención por su aspecto sanguinolento o mucoso, pues es allí donde abundan los microorganismos patógenos.

La inoculación se efectuará sobre medios de cultivo propios y selectivos de los principales patógenos intestinales, incluyendo, dada su importancia, un medio de enriquecimiento para Salmonella (selenito o tetrationato). Las cepas de Salmonella aisladas se identificarán por pruebas bioquímicas y se confirmará su identidad mediante un polivalente serológico. No es necesario que los pequeños laboratorios dispongan de todo el amplio material perecedero para serotipificar a Salmonella. La presencia de Shigella también se confirmará serológicamente.

Es discutible la inclusión rutinaria de métodos y medios para el diagnóstico de Vibrio cholerae y Campylobacter. El primero porque es poco frecuente y además porque las características clínicas del paciente y las de la muestra ya orientarían hacia ello en caso necesario. Se valora la muestra, concediendo especial importancia a la edad del paciente y a la consistencia del producto.

CARACTERISTICAS DE BACTERIAS PATOGENAS

A continuación se precisan algunas características clínicas y de cultivo de las bacterias reconocidas como enteropatógenas y se discuten las de alguna cuya etiología es dudosa.

Salmonella : Las últimas tendencias en taxonomía aceptan el establecimiento de una sola especie de Salmonella. Le Minor, en la última edición de «EI Manual de Bergey» (1984), propone como única especie a Salmonella choleraesuis subdividida en seis subespecies.

En el XIV Congreso Internacional de Microbiología celebrado en Manchester (1986), el Comité Internacional de Sistemática Bacteriana a través del Subcomité Internacional de Enterobacteriaceae , ha decidido modificar el nombre de Salmonella choleraesuis , propuesto por Le Minor, por el de Salmonella enterica , quedando los gérmenes conocidos tradicionalmente como S. enteritidis , S. typhimurium, S. dublin, etc., en la categoría de serotipo, biotipo o bioserotipo dentro de su correspondiente subespecie (datos facilitados por el doctor Usera. Majadahonda).

De forma general se podría decir que la Salmonella produce dos cuadros clínicos muy diferenciados, y que en ambos casos puede hacerse el diagnóstico a partir del coprocultivo.

Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero está producido por Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo está causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis,Salmonella Choleraesuis, etc. En contra de esta clara diferenciación, aceptada por todos, hay autores que señalan que pierde valor cuando se trata de niños, y que en ellos cualquier Salmonella puede producir los dos síndromes.

El diagnóstico de la fiebre tifoidea puede hacerse por métodos directos y por métodos indirectos. Los primeros son aquéllos que permiten aislar el microorganismo, como son: el hemocultivo y el coprocultivo. Aveces, aunque es raro, se puede aislar también el germen de la orina.

Los métodos indirectos son aquellos que ponen de manifiesto la acción del germen sobre el organismo, es decir, demuestran la presencia de anticuerpos específicos contra el agente etiológico.

– El hemocultivo presenta un máximo de positividad durante la primera semana. – El coprocultivo permite aislar con un 30-50 por 100 de posibilidad Salmonella durante todo el transcurso de la enfermedad, siempre y cuando el paciente no esté bajo tratamiento.

Para aislar Salmonella, las siembras de las heces se efectuarán sobre medios de enriquecimiento selenito de Leifson, y al mismo tiempo sobre medios selectivos como el Hektoen resembrando a las doce-dieciséis horas de incubación un asa de las primeras en una placa de estos últimos. Con las colonias sospechosas se realizarán pruebas de identificación.

En el otro síndrome clínico, es decir, la infección gastrointestinal, el coprocultivo es a menudo el único método que permite demostrar la etiología.

El hemocultivo es sólo efectivo en algunas ocasiones.

Shigella : Existen cuatro grupos de Shigella, representados respectivamente por Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, y Sh. boydii.
La Shigella es un germen muy lábil y que resiste muy poco tiempo en las heces del organismo humano, a esto se debe la necesidad de sembrar lo antes posible las muestras sospechosas de contener Shigella.
El medio de cultivo más utilizado es el selectivo llamado SS, o Salmonella-Shigella, que se siembra con ún inóculo abundante.

La Shigella es productora de la disentería bacteriana, y de muchas colitis en verano. A pesar de ser la responsable de las citadas enfermedades, en la actualidad la tendencia es no tratar las infecciones debidas a este microorganismo. En España no es frecuente la Sh. dysenteriae, siendo la más común Sh. sonnei.

Vibrio : Hay varias especies del género Vibrio que son responsables de distorsiones intestinales. La más importante, Vibrio cholerae, produce su efecto gracias a una toxina muy semejante a la del E. coli enteropatógeno. En los casos típicos, las heces presentan un aspecto conocido como agua de arroz, debido a su color blanco y consistencia líquida, con grumos que contienen gran cantidad de pequeños bacilos gramnegativos ligeramente curvados.

El aislamiento de las heces se hace utilizando medios selectivos, como el agua de peptona alcalina (pH 8,4), o el de Nakanishi modificado o TCBS, a base de tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa.

Otros vibrios semejantes al Vibrio cholerae, como su biotipo El Tor, y los vibrios NAG o no aglutinables, fabrican de igual forma la citada enterotoxina, poseyendo estos últimos también un cierto efecto invasor del tejido intestinal.

Si los vibrios NAG se encuentran principalmente en aguas dulces, el Vibrio parahaemolyticus vive en el agua del mar, dándose cada vez con mayor frecuencia cuadros de gastroenteritis transmitidos a partir de los llamados frutos del mar (mariscos y pescados poco cocidos).

Yersinia : Es otro miembro de la familia Enterobacteriaceae que suele producir trastornos intestinales. De sus tres especies, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis, sólo las dos primeras están implicadas en los citados procesos, especialmente la inicial.

La Yersinia enterocolitica produce gastroenteritis aguda, caracterizada por diarrea líquida.
La Yersinia enterocolitica crece bien en medios ordinarios como el agar SS o el agar desoxicolato. Aunque las colonias aparecen a las cuarenta y ocho-setenta y dos horas, su pequeñez y poca proporción en ocasiones les hace pasar desapercibidas. Para facilitar su aislamiento se utilizan medios selectivo 4º C durante tres semanas en selenito o BHI. Lógicamente, los diagnósticos hechos con estos procesos de enriquecimiento no son válidos para implantar un tratamiento clínico, pero sí para estudios epidemiológicos.

Indirectamente puede hacerse el diagnóstico enfrentando suero del paciente con una mezcla polivalente, o, cuando menos, que contenga los serotipos 3 y 9. Títulos iguales o superiores a 1/160 son significativos.
Escherichia coli : Gracias a los trabajos empezados por Kauffmann, y sobre la base de 157 antígenos somáticos (0), 93 capsulares (K) y 52 flagelares (H) de los que hay tres variedades (L, A y B), es posible identificar serológicamente a E. coli.

Esta determinación serológica, en la práctica diaria de los laboratorios de microbiología, sólo se realiza para la investigación de una serie de Escherichia denominados enteropatógenos, y cuya patología parece reducirse a gastroenteritis infantiles en niños menores de dos años y medio.

Ahora bien, en la actualidad se duda de su verdadera intervención, pues es posible aislarlos de muchas heces infantiles que no tienen síntomas de gastroenteritis. En casos aislados sólo podremos imputarle con seguridad la etiología del proceso si comprobamos su capacidad enteropatogénica. E. coli enteropatógeno puede efectuar de dos maneras su acción intestinal, una produciendo enterotoxinas, de las cuales se conocen dos (ST o estable al calor y LT o lábil al calor, que es parecida antigénicamente a la enterotoxina de V. cholerae ) y otra por la invasión de las células epiteliales del intestino, produciendo un cuadro disenteriforme, denominándose respectivamente E. coli enterotoxigénico y E. coli enteroinvasivo.

Anaerobios esporulados : Los anaerobios esporulados no suelen producir infecciones gastrointestinales, y sólo se cita con escasa frecuencia la presencia de Clostridium perfringens causante de intoxicaciones alimentarias. También se han mencionado casos de colitis pseudomembranosa debidos a Clostridium difficile.

Otros microorganismos que con menor frecuencia se consideran responsables de gastroenteritis son los siguientes:

Candida : sobre todo Candida albicans, que es aislada mayoritariamente de heces patológicas de niños pequeños. En ocasiones es posible su hallazgo en el contenido fecal de adultos con trastornos intestinales recién llegados de patses del Medio y Lejano Oriente.
Pseudomonas : Frecuente en personas tratadas largo tiempo con antibióticos de amplio espectro.

Staphylococcus aureus : Su presencia es favorecida también por terapia con antibióticos de amplio espectro. Además de este efecto por sobrecrecimiento, son muy frecuentes las intoxicaciones alimentarias por la enterotoxina, producida por el microorganismo.

Campylobacter : Desde hace algún tiempo se reconoce a Campylobacter jejuni como el patógeno intestinal con mayor morbilidad. Generalmente afecta a niños pequeños, a los que produce diarrea y a veces vómitos
La fuente de infección suele ser el agua, o, más frecuentemente, los alimentos de origen animal. También se encuentra en abundancia en las heces de animales domésticos.

El desarrollo de su patología no está bien definido, ya que mientras que, por un lado, produce manifestaciones enteroinvasivas (con producción de sangre y leucocitos), por otro, hay constancia de que libera una enterotoxina similar a la de Vibrio cholerae y E. coli enterotoxigénico.

Para el diagnóstico microbiológico, la siembra de las heces debe hacerse muy rápidamente, preferiblemente antes de dos horas. En caso de no ser posible, se incluirá la muestra en un medio de transporte adecuado (el mejor es el de Cary-Blair).

Para el cultivo de Campylobacter se precisan unas condiciones especiales, que son: disponer de un medio selectivo, temperatura de incubación de 42-43° C y atmósfera microaerofílica (reducida de oxígeno) con C02.

Hay varios medios de cultivo selectivos apropiados, la mayoría de ellos comercializados, como el Skirrow, el Butzler o el Campy BAP, no siendo necesario utilizar ningún medio de enriquecimiento previo.

La incubación a 42-43° C se realiza por espacio de cuarenta y ocho-setenta y dos horas en una atmósfera que contiene un 5 por 100 de 02, 10 por 100 de C02 y 85 por 100 de N2.
Con las colonias sospechosas crecidas en los medios antes mencionados, se efectúa una identificación presuntiva, observando su morfología bacilar gramnegativa en espiral (es mejor usar como colorante de contraste fucsina fenicada al 0,3 por 100), su movilidad característica y la capacidad de dar positiva la prueba de la oxidasa.

Se puede completar la determinación con una batería de pruebas bioquímicas, de las cuales destacamos la catalasa, la reducción de nitratos, la producción de SH2 y la hidrólisis del hipurato.

Aeromonas : Aeromonas hydrophila se aísla con relativa frecuencia de heces diarreicas, habiéndose comprobado su capacidad enterotóxica y enteroinvasiva.
Otros enteropatógenos son  Streptococcus faecalis variedad , que produce toxiinfección, y Bacillus cereus, que da lugar a intoxicaciones.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Generalmente se admiten tres matizaciones para definir el resultado de un estudio microbiológico intestinal:

a) Presencia de gérmenes enteropatógenos. 

b) Ausencia de gérmenes enteropatógenos. 

c) Disbacteriosis intestinal.


El tercer apartado podría ser más discutible. Se entiende por disbacteriosis la presencia mayoritaria de un tipo de microorganismo que generalmente está en poca o inapreciable proporción. Dicho de otra forma, cualquier tipo de microorganismo distinto de E. coli que crezca en abundancia en un medio diferencial para Enterobacteriaceae, como, por ejemplo, el EMB.