Diagnóstico microbiológico de las infecciones del tracto respiratorio inferior

¿Cómo se procesan las muestras?

Una vez que llegan las muestras al laboratorio, se realiza una tinción de una extensión de dichas muestras tras haberla colocado sobre un portaobjetos. Así se puede observar la morfología de los microorganismos presentes en la muestra y las características tintoriales.
Tras esto se procede a inocular distintos medios de cultivo que serán incubados en estufas a distintas temperaturas.
Estos medios de cultivo se examinarán diariamente para detectar el crecimiento de los posibles microorganismos existentes en las muestras.
Una vez que se detecta el crecimiento de algún microorganismo se procede a su identificación mediante distintas pruebas bioquímicas y se realiza una antibiograma (para estudiar la sensibilidad del microorganismo aislado frente a distintos antibióticos).

¿Qué técnicas se emplean dependiendo del germen causante?
MICROORGANISMO	TÉCNICA DIAGNÓSTICA
Neumococo	Tinción de Gram Cultivo en agar sangre + sensibilidad a la optoquina Detección de antígeno polisacárido en distintas muestras
Haemophilus influenzae	Tinción de Gram Cultivo en agar chocolate + requerimientos nutricionales Detección del polisacárido capsular
Moraxella catarrhalis	Tinción de Gram Cultivo en agar sangre + pruebas bioquímicas
Enterobacterias	Tinción de Gram Cultivo en agar Mc Conckey + pruebas bioquímicas
Mycoplasma pneumoniae	Cultivos en medios especiales Serología
Chlamydia pneumoniae	Cultivos celulares Serología
Legionella spp.	Tinción de Gimenez Cultivo en medios especiales (BCYE) Inmunofluorescencia directa Serología Detección de antígeno en orina
Mycobacterium tuberculosis	Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción de auramina Cultivos en medio sólido (Lowenstein, Coletsos) Cultivos en medio líquido (Middlebrook 7H9) PCR sobre muestras respiratorias
Micobacterias atípicas	Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción de auramina Cultivos en medio sólido (Lowenstein, Coletsos) Cultivos en medio líquido (Middlebrook 7H9) PCR sobre muestras respiratorias
Criptococcus neoformans	Tinciones de plata Cultivo en medios para hongos (Sabouraud)
Virus	Técnica de Shell-vial Cultivos sobre líneas celulares Serologías
Hongos y levaduras	Cultivos en medios especiales (Sabouraud)
Pneumocystis carinii	Tinciones de plata Inmunofluorescencia directa
Ascaris lumbricoides	Exámen en fresco de secreciones respiratorias

  Técnicas microbiológicas para el diagnóstico de las infecciones.

El diagnóstico microbiológico es el conjunto de procedimientos y técnicas complementarias empleadas para establecer la etiología del agente responsable de una enfermedad infecciosa y poder así proceder a su tratamiento y a tomar, en caso de que fuera necesario, las medidas correspondientes para evitar la diseminación del patógeno.

Para llevarlo a cabo, se parte de la información acumulada por el médico y que se recoge en la historia clínica del paciente en forma de síntomas, signos y diagnóstico clínico más probable a su entender.

El diagnóstico microbiológico en bacteriología puede clasificarse en distintos tipos:
Directos: Implican la demostración del agente patógeno, sus metabolitos o alguno de sus componentes antigénicos en los fluidos orgánicos del paciente.

Indirectos: Implican la demostración de la huella que el agente patógeno ha dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del paciente.

A la hora de llevar a cabo la identificación es imprescindible la labor del laboratorio, que nos aportará datos preliminares o definitivos sobre los agentes patológicos causantes de la afección. Para ello, se lleva a término un procedimiento ordenado que comprende:

1.- Toma de muestras (esputo, sangre, heces, tejidos…) que dependerán de la sospecha de procedencia de la afección.
2.- Observación al microscopio, si procede, de la muestra
3.- Obtención de colonias aisladas, cultivo.
4.- Identificación del género y de la especie mediante test bioquímicos, genéticos, inmunológicos.
5.- Test de sensibilidad a los antibióticos (punto de corte, antibiograma, MIC)
6.- Informe al clínico, quien procederá a establecer el tratamiento fundamentado en el diagnóstico microbiológico o a modificar un tratamiento empírico administrado debido a la gravedad de la infección.

A la hora de tomar las muestras microbiológicas, debemos de hacerlo con el mayor rigor posible, sien do para ello muy importante el cumplimiento de los siguientes requisitos que permitirán garantizar el resultado correcto del estudio:

Elegir el material que refleje el proceso patológico.

Evitar contaminación con la flora del paciente.

Obtener volumen suficiente para observación microscópica y cultivo.

Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia antimicrobiana.

Transportar la muestra rápidamente al laboratorio.

Una vez tenemos las muestras adecuadas, podemos comenzar a realizar las técnicas diagnósticas correspondientes. Dentro del diagnóstico microbiológico incluiremos:

1.- Examen microscópico
2.- Crecimientos en cultivos
3.- Evidencia indirecta del crecimiento
4.- Técnicas inmunitarias

Cada una de estas técnicas tiene sus ventajas y sus inconvenientes, pero son todas ellas muy necesarias para un buen resultado final.

EXAMEN MICROSCÓPICO:

La visualización de los microorganismos patógenos es la técnica más evidente. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y a la similitud estructural existente entre algunos de ellos, se generan numerosas complicaciones. Para evitar el problema del tamaño, se utilizan sistemas de ampliación de imagen como lupas o microscopios. Las tinciones diferenciales y específicas, nos permitirán paliar el problema de la similitud.

Habitualmente, la visión microscópica de los agentes patógenos no nos ofrecerá un diagnóstico definitivo, sino una orientación diagnóstica. Sin embargo, la visualización de estructuras específicas puede ser un hecho que nos garantizará una determinación garantizada. Los microscopios ópticos permiten ver bacterias, hongos y protozoos. Para ver virus es necesaria una resolución mucho mayor que sólo alcanza el microscopio electrónico, mientras que las tenias y trematodos no requieren técnicas de ampliación de imagen.

Los exámenes en fresco dejan visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teñirlos, y por tanto vivos. Éstos, son especialmente importantes en las infecciones producidas por parásitos intestinales puesto que pueden detectar huevos, quistes y trofozoitos que por sus características morfológicas pueden generar por si solas un diagnóstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse antes de realizar la preparación en fresco con el fin de aclarar y concentrar los parásitos. También las infecciones producidas por Tricomonas vaginalis se diagnostican de este modo en el exudado uretral.

En ocasiones la visualización en fresco es insuficiente para diferenciar los microorganismos y es necesario aumentar el contraste respecto al medio en que se encuentran. Para ello se utilizan las tinciones, que posibilitan la observación de la cantidad, tamaño, morfología y disposición relativa de los microorganismos. Las tinciones suponen la muerte de los microorganismos ya que todas tienen un paso previo de fijación al portaobjetos que se realiza con calor o con lavado en alcoholes. A continuación, se aplican sustancias coloreadas que tiñen la superficie de los microorganismos.

Se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien diferenciales cuando usan más de uno y tiñen de forma específica distintas estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las más utilizadas ya que ofrecen más información diagnóstica. Algunas de las más importantes son:

a) Tinción de gram

A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tinción de gram es la más utilizada en el diagnóstico microbiológico. De tal modo que la información que ofrece de la composición de la pared bacteriana es la base de todas las clasificaciones en este reino. Se trata de una tinción diferencial que distingue entre bacterias con pared gruesa (gram positivas) y bacterias con pared fina y membrana externa (gram negativas).

Esta prueba utiliza violeta de genciana como colorante primario. Tras su aplicación todos los microorganismos se tiñen de violeta. Después el lugol actúa como mordiente, acentuando la penetración del colorante primario. El tercer paso consiste en la aplicación de una mezcla de alcohol y acetona que elimina el violeta excepto en las bacterias con pared gruesa. Por último el colorante secundario o de contraste, la safranina, tiñe de rojo las bacterias decoloradas, es decir las de pared fina. En resumen las bacterias gram positivas quedan teñidas de violeta y las gram negativas de rojo.

b) Tinción de Ziehl-Neelsen

También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para unas bacterias con estructura de pared única, las micobacterias. La pared de las micobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se produce en casi ningún otro tipo bacteriano.

La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes. (BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.

Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.

c) Tinción de auramina.

La auramina es un compuesto que se une específicamente a las bacterias ácido-alcohol resistentes y que emite luz verde brillante cuando es excitado con luz ultravioleta. Se utiliza en el diagnóstico de tuberculosis. En las muestras de esputo de pacientes con esta enfermedad pueden aparecer bacilos que emiten luz verde manzana en el microscopio de fluorescencia cuando se tiñen con auramina.

Esta técnica es la más utilizada el diagnóstico de tuberculosis, pero también es útil para la detección de otros patógenos como los quistes de Cryptosporidium, protozoo parásito intestinal causante de diarreas en individuos inmunocomprometidos.

CRECIMIENTOS EN CULTIVOS

Denominamos cultivo al proceso de laboratorio por el que se induce el crecimiento cuantitativo de los agentes patógenos. Para conseguir su crecimiento de manera artificial es necesario un aporte nutritivo suficiente así como las condiciones físicas adecuadas para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de cultivo.

Por lo general, todos los microorganismos necesitan unos elementos imprescindibles que incluyen fuentes de energía, de carbono, algunas sales y elementos y por supuesto agua. Algunos requieren además otras sustancias adicionales como vitaminas o aminoácidos esenciales para cada especie.

Al igual que ocurre con su nutrición, no todos necesitan las mismas condiciones físicas para crecer, por lo que hay que individualizar la temperatura, la humedad, el pH y otras características si queremos que nuestros cultivos salgan adelante.

En los laboratorios de microbiología podemos encontrar medios de cultivo líquidos y sólidos. En los medios líquidos las sustancias nutritivas se encuentran disueltas mientras que los sólidos llevan habitualmente una base de agar que es líquido a altas temperaturas y solidifica al enfriarse. Este medio mantiene la humedad y conserva los nutrientes necesarios, permitiendo que los organismos formen colonias sobre él.

Es por esto que los cultivos sólidos tienen una serie de ventajas que se resumen en la posibilidad de cuantificar el número de unidades formadoras de colonias (previa dilución) y en la capacidad para identificar preliminarmente un microorganismo basándonos en las características de la colonia formada (tanto color como morfología).

Hay muchos medios diferentes desarrollados para abarcar el máximo número posible de agentes patógenos. Según su capacidad para soportar el crecimiento microbiano se clasifican en medios generales (para el crecimiento de la mayoría), de enriquecimiento (para bacterias y hongos sobretodo), selectivos (fomentan el crecimiento de determinados agentes mientras que evitan la aparición de otros) y diferenciales (distinguen entre distintos agentes casi siempre en función de las colonias).

Algunos de los medios de cultivo más utilizados en el laboratorio son:

a) El agar sangre y el agar chocolate

Son los medios más frecuentemente empleados y entran dentro de la categoría de medios generales. Están formados por nutrientes, agar y sangre de caballo o carnero que constituye un suplemento. La única diferencia entre ambos es que en el agar chocolate la sangre está hemolizada (los nutrientes quedan a disposición de los microorganismos.

b) agar de Sabouraud.

Es un medio de cultivo para hongos más ácido y que contiene más hidratos de carbono que los usados para las bacterias. Se siembra utilizando la técnica de aislamiento (levaduras) y se cultiva (28-34ºC) para observar las características de las colonias (forma, color, bordes, brillo, textura). Los hongos filamentosos (o miceliales) crecen más lentamente 7-15 días

c) Otros medios

El agar McConkey es un medio selectivo para gram negativos. También existen los medios de manitol salado, caldo selenito, agar Campylosel (para Campylobacter) o el medio CIN (para Yersinia).

El medio de Schaedler es un medio sólido que se utiliza para el cultivo de microorganismos anaerobios mientras que los medios de Mueller-Hinton con y sin sangre son los estandarizados en la realización de pruebas de antibiograma.


EVIDENCIA INDIRECTA DEL CULTIVO

Siendo el más evidente el efecto citopático de algunos virus. Este efecto consiste en los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, causados durante el ciclo de replicación viral y visibles mediante la microscopía óptica.

La mayor parte de las visiones del efecto citopático se han dado en células infectadas en cultivo, en las que se puede llegar a observar una pérdida de adherencia al sustrato, una inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, transformación celular, etc. Aunque todos los virus líticos producen este tipo de efectos, pueden observarse una gran cantidad de manifestaciones distintas.

TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

Se pueden realizar llevando a cabo una detección de antígenos específicos del patógeno o por la detección de secuencias específicas en los ácidos nucleicos del microorganismo. En cualquier caso requiere la utilización de técnicas específicas como la realización de sondas de ADN/ARN o la amplificación génica.

Además de estas técnicas diagnósticas, se pueden realizar una serie de pruebas de sensibilidad a los antibióticos que serán francamente útiles a la hora de pautar un tratamiento contra la afectación.
Respecto a estas pruebas, debemos de tener en cuenta que las bacterias pueden adquirir genes de resistencia o experimentar mutaciones en su ADN que les confieran inmunidad frente a uno o más antibióticos. Para determinar si una cepa microbiana es sensible a los antibióticos se utilizan estas pruebas:

a) Técnica de difusión en agar (método de Kirby-Bauer).

Es una prueba estándar internacional. Se utiliza un inóculo bacteriano que incluye un número conocido de bacterias para sembrar un medio de cultivo (placa de Petri). Posteriormente, se depositan unos discos de papel impregnados con una concentración determinada de antibiótico.

Después, la placa es incubada durante unas 24 horas para permitir el crecimiento bacteriano confluente. Alrededor del disco donde se difundió el antibiótico, la bacteria no crecerá (zona de no crecimiento), denominándose esta zona "halo de inhibición".

A continuación se mide el diámetro y se compara las medidas
estándar dadas para ese antibiótico. El tamaño del halo de inhibición permite determinar si el aislado clínico es sensible o resistente a un antibiótico.

b) Determinación del punto de corte (breakpoint )

Se determina si la especie bacteriana puede crecer o no en presencia de una concentración única de antibiótico considerada crítica para la multiplicación de esa especie bacteriana. Es la utilizada habitualmente en hospitales en los test automatizados.

c) Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CIM)

Es la mínima concentración de antibiótico que impide el crecimiento bacteriano visible a las 24 horas de cultivo.
Por último, una pequeña reseña sobre el diagnóstico de las infecciones causadas por hongos o virus.

a) Diagnóstico de las infecciones causadas por hongos:

Además del cultivo en Agar de Sabouraud (ya comentado anteriormente) se puede realizar una observación al microscopio, que se da sobre todo cuando se realiza la inspección de hongos filamentosos,

 viéndose hifas (en las que miraremos el grosor, tabiques, ángulo de las ramificaciones) y cuerpos fructíferos (lugar de formación de esporas del hongo).

También se pueden realizar test bioquímicos, utilizando sobretodo hidratos de carbono o compuestos nitrogenados para identificar levaduras, test inmunológicos, que detectarán antígenos específicos de algunas especies de hongos, e identificaciones genéticas mediante reacciones en cadena de la polimerasa.

b) Diagnóstico de las infecciones virales

Se realiza mediante la detección de antígenos en sangre y cultivos celulares, aunque también por la serología con detección de anticuerpos (teniendo en cuenta que una persona infectada va a sintetizar anticuerpos frente al virus que le ataca).

En los posibles cultivos, observaremos los ya conocidos efectos citopáticos y no debemos olvidar las identificaciones genéticas mediante reacciones en cadena de la polimerasa y las identificaciones por microscopio electrónico, aunque sean raramente usadas en la clínica.