Exudado faringeo: protocolo de rutina

Estudio microbiológico de faringe y nasofaringe

INTRODUCCIÓN

El estudio microbiológico del frotis faríngeo es una prueba muy solicitada, sobre todo entre la población infantil y a la que hay que dar su verdadero valor. En principio el frotis faríngeo servirá sólo para los propósitos expuestos en los apartados siguientes:

Para diagnosticar: angina estreptocócica (Streptococcus beta-hemolítico del grupo A), difteria, muguet, angina de Vincent, infección por Haemophilus.

Para establecer focos de infección en enfermedades como: fiebre reumática (Streptococcus betahemolítico del grupo A), glomerulonefritis hemorrágica aguda (Streptococcus beta-hemolítico del grupo A), escarlatina (Streptococcus beta-hemolítico del grupo A), endocarditis (Streptococcus viridans ), tos ferina (Bordetella ).

Para detectar portadores de: Staphylococcus aureus, Streptococcus beta-hemolítico del grupo A, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphteriae.

Hay una tendencia general a no investigar el neumococo (Streptococcus pneumoniae ) en garganta, pues está presente en muchas personas que no presentan ninguna sintomatología (30 por 100 de portadores sanos).

OBTENCION DE LA MUESTRA Y METODOLOGIA

Para la toma de muestras de faringe se dispondrá de dos hisopos, preferentemente humedecidos en un caldo, como tripticasa de soja. Se utilizará un depresor lingual y se evitara rozar cualquier parte de la lengua.

Con los hisopos se tocará el fondo de garganta, amigdalas, fosas tonsilares, y cualquier otro lugar donde exista inflamación, exudado o ulceración. Uno de ellos se utilizará para hacer tinciones, y el otro para hacer cultivos.

Algunos gérmenes, como Haemophilus, Bordetella, o Neisseria meningitidis, pueden hallarse en mayor abundancia en nasofaringe. En estos casos, la toma de muestras se realizará con escobillones flexibles de acero o alambre cromado, introduciéndolos por la nariz hasta la faringe posterior, de donde se intentará extraer una pequeña porción de moco. Puede también efectuarse doblando el hisopo e introduciéndolo con cuidado a través de la boca, por detrás de la úvula.

Para el estudio de portadores de Staphylococcus y de Streptococcus, se suelen utilizar frotis de la parte anterior de la nariz, los cuales se siembran en medios selectivos. Así para la investigación de portadores nasales de Staphylococcus aureus, se divide una placa de agar Chapman, o agar manitol sal, por la mitad y, respectivamente en cada una de ellas se siembra la toma efectuada en cada fosa nasal. La toma de muestras se efectuará en el laboratorio. Si no fuera posible, se introducirán los escobillones con la muestra en algún medio de transporte, como el Stuart o el Amies (con o sin carbón) y se enviarán rápidamente. Este procedimiento, que sirve para la mayoría de microorganismos, dificulta en cierta manera la posterior visualización de los frotis teñidos. Es menos correcto el guardar las muestras refrigeradas, sobre todo en el caso de que buscásemos meningococos, ya que se lisan con el frío.

Una forma correcta de hacer la siembra, es frotando un extremo de la placa con el hisopo y después extendiendo el producto con el asa de platino.

Características microbiológicas de los patógenos
más frecuentes. A continuación se exponen algunas características microbiológicas de los microorganismos mencionados.

Bordetella pertussis: Se investiga para el diagnóstico microbiológico de la tos convulsa, coqueluche o tos ferina. Otras especies de Bordetella pueden producir cuadros parecidos, pero son muchos menos frecuentes.

Para la toma de muestras se aconsejan dos técnicas. La primera es la de hacer toser al paciente directamente sobre una placa abierta con medio de Bordet-Gengou. La segunda consiste en introducir un hisopo de alambre por la nariz hasta que toque pared faríngea; depositar la toma sobre un extremo de una placa de Bordet-Gengou, y extenderla con un asa de platino.

La incubación será en aerobiosis a 35-37° C durante cuatro días. Las colonias de Bordetella poseen forma de gotas de mercurio, y la confirmación se hace facilmente con antisueros.

Existen técnicas rápidas de diagnóstico de coqueluche basadas en la utilización de anticuerpos fluorescentes directamente sobre extendidos pernasales.

Corynebacterium diphteriae: Es muy importante saber establecer un diagnóstico, aunque éste sea sólo presuntivo. Para la toma de muestras se procurará coger parte de la pseudomembrana, que se extenderá y coloreará. Si en el examen microscópico se visualizan bacterias de apariencia sospechosa difteromorfa, se avisará al clínico inmediatamente para que tome las medidas oportunas y establezca el tratamiento.

Entre tanto se proseguirá el estudio por siembra en medio de Loeffler, o en placa de agar chocolate telurito.

Las extensiones de las colonias crecidas después de una incubación a 35-37° C mostrarán bacilos difteromorfos unidos por sus extremos, recordando letras del alfabeto chino.

Aparte de la identificación bioquímica, es conveniente investigar si el germen es productor de toxina

Es interesante que el microbiólogo sepa diferenciar de entrada a otros microorganismos que producen lesiones pseudomembranosas parecidas a la difteria, como algunos estreptococos, o a los agentes etiológicos de la angina de Vincent.

Streptococcus sp. : El género Streptococcus está siempre presente en nasofaringe, por eso es de enorme importancia el saber diferenciar las especies que son patógenas de aquellas otras que no lo son.

Es muy orientativa la hemólisis que producen los estreptococos sobre agar sangre de carnero al 5 por 100. Streptococcus beta-hemolíticos, son los más patógenos de todos, sobre todo el perteneciente al grupo A de Lancefield (Streptococcus pyogenes ), que es el agente etiológico de la escarlatina, erisipela, fiebre reumática, amigdalas, etc.

Streptococcus alfa hemolíticos: Cabe destacar a los Streptococcus viridans, y Streptococcus pneumoniae. El primero es uno de los microorganismos saprófitos más frecuentes en garganta, y prácticamente nunca se da valor a su aislamiento –hay raras excepciones como su aislamiento en exéresis quirúrgica dental en paciente con valvulopatía aórtica, etc.–; el segundo se encuentra en pequeña proporción en un elevado porcentaje de gargantas normales. En determinadas ocasiones de pacientes pediátricos que no expectoran pueden ser útil su búsqueda en nasofaringe.

Streptococcus gamma-hemolíticos. Generalmente son saprófitos. Entre ellos destacan los pertenecientes al grupo D de Lancefield, que a veces son capaces de producir alfa o beta-hemólisis, y que en alguna ocasión se han descrito como patógenos faríngeos. En este caso también se encuentran en forma predominante.

Haemophilus influenzae: Ocupa el tercer lugar entre los microorganismos productores de faringitis en niños, después de virus y Streptococcus pyogenes. Es un microorganismo bastante lábil que precisa de medios enriquecidos para su crecimiento. Sirve para este fin el agar chocolate.

Se diferencia de otras especies por las distintas necesidades que tienen de los factores V y X de la sangre, técnica que puede efectuarse sobre medio Mueller Hinton, con la ayuda de discos impregnados y observando sus características auxonotróficas.

Es conveniente recordar que el agar sangre humana o de cordero inhiben a Haemophilus.

Borrelia vincentii y Fusobacterium nucleatum••. Angina fusoespiralar de Vincent : Es una infección pseudomembranosa y ulcerativa de la boca, encías o faringe. Está causada por una espiroqueta gramnegativa (Borrelia vincentii ) y un bastoncillo gramnegativo anaerobio, recto o ligeramente curvo, de puntas agudas (Fusobacterium nucleatum ) en asociación con otros gérmenes de la cavidad bucal (saprófitos ).

Es fácil de diagnosticar directamente por coloración de Gram, observándose las formas descritas (espiroquetas de cinco-siete espiras abiertas y fusobacterias en forma de cigarro, acompañadas de numerosas células de pus y de descamación). En infecciones agudas predominan las espiroquetas, y en las crónicas las fusobacterias.

Al ser gérmenes que se encuentran en boca y encías normales, es conveniente relacionar su presencia con, inflamación de la boca.

Candida sp. : A veces las levaduras del género Candida producen infecciones intraorales denominadas «muguet

La toma de muestras se efectuará de las membranas blanquecinas que se presentan adheridas a diversas partes de la mucosa oral.

Las siembras se practicarán sobre agar Sabouraud- cloranfenicol, aunque el agar sangre también permite un perfecto crecimiento. Las distintas especies de Candida se investigarán mediante pruebas morfológicas, zimograma y auxonograma de azúcares.

Neisseria meningitidis : La investigación de portadores nasofaríngeos de meningococos se efectúa tomando la muestra con hisopos doblados que se introducen por debajo de la úvula hasta la pared de la nasofaringe, o a través de la nariz, llegando a la pared posterior. En cualquier caso, cuando el hisopo toque fondo se le dará un ligero movimiento de rotación, con el fin de que capte una cierta porción de mucus, que será el que teñiremos y sembraremos en busca del microorganismo. El medio de cultivo utilizado puede ser el agar chocolate, aunque consigue mejores resultados el agar Thayer Martin.

Se investigarán las colonias pequeñas, grises, algo mucoides y oxidasa positivas. Pruebas bioquímicas para su confirmación, entre las que destacan las de actuación sobre azúcares (glucosa y maltosa).

Coprocultivo:protocolo de rutina

Estudio microbiológico de las heces. Coprocultivo 

INTRODUCCION

Las afecciones gastrointestinales de etiología microbiana pueden estar producidas por una gran variedad de protistas, ya sea directamente por sí mismos, que al penetrar en el intestino en una determinada proporción establecen cambios ecológicos importantes, desplazando a la flora autóctona allí existente, o indirectamente, por la secreción de diversos fermentos y toxinas que alteran la motilidad y permeabilidad de la membrana intestinal.

El primer caso podemos definirlo como infección intestinal, y el segundo –dependiendo de si la elaboración del producto metabólico del microorganismo se hace antes o después de su ingestión por el paciente– se llamará respectivamente, intoxicación alimentaria o toxiinfección.

Los productos intestinales de una persona sana incluyen un gran número de microorganismos saprófitos, que fabrican entre sus productos metabólicos una variada cantidad de sustancias vitamínicas, que son fácilmente aprovechadas por el hospedador.

Estas bacterias ocupan principalmente el colon y la parte terminal del íleon, representando, según distintos autores, entre 1/3 y 1/8 del peso seco de las heces. Esta variación cuali y cuantitativa está condicionada por la edad y por el régimen alimenticio seguido.

En el niño mayor y en el adulto, los anaerobios, que presentan ambas coloraciones frente al método de Gram, son aún el tipo predominante; entre los aerobios la proporción aproximada es la siguiente:

– E. coli y coliformes: 80 por 100.
– Enterococos: 14 por 100.
– Staphylococcus y Streptococcus : 4 por 100.
– Proteus : 1 por 100. 
– Otros: 1 por 100.

Al igual que en el lactante, la dieta alimenticia varía la composición de la flora intestinal del adulto; así, si la nutrición se hace principalmente con proteínas, aumenta la flora gramnegativa, y cuando predominan los hidratos de carbono se favorece la presencia de la grampositiva.

Entre los principales patógenos intestinales podemos considerar a los siguientes:

– Virus: Rotavirus, Enterovirus, Parvo-Picornavirus, Astrovirus, Coronavirus.

–Protozoos: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia. 

–Levaduras: Candida albicans.

– Bacterias: Salmonella sp., Shigella sp., Vibrio cholerae, Vibrio El Tor, Vibrio NAG, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli enteropatógeno, Campylobacter, Pseudomonas, Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, y otros menos frecuentes como Mycobacterium tuberculosis, etc.

Al igual que en el caso de otras muestras humanas, sería conveniente que el clínico orientase al laboratorio sobre el proceso de infección y la etiología sospechosa.
Es preciso recordar que las intoxicaciones alimentarias, es decir, las debidas a toxinas producidas fuera del hospedador y después ingeridas, generalmente no cursan con fiebre y tienen un período de incubación muy corto; en cambio, las producidas directamente por microorganismos cursan habitualmente con fiebre y tardan más en aparecer.

RELACION ENTRE ALGUNOS TIPOS DE GASTROENTERITIS
Microorganismos	Patología causada por (2)	Período de incubación (3)	Síntomas comunes (4)
Staphylococcus aureus.	Toxina (termoestable).	2-6 horas.	Náuseas, vómitos, calambres abdominales, diarrea (30 %).
Salmonella.	Infección	12-36 horas.	Diarrea, dolor abdominal.
Shigella	Infección	24-72 horas.	Diarrea líquida con mucus.
Clostridium perfringens.	Toxina (moderadamente termoestable)	6-12 horas.	Diarrea, calambres.
Clostridium botulinum.	Toxina (termoestable)	Variable (de horas a días)	Gastroenteritis inicial seguida por efectos de tipo curare.
(1) La tabla describe algunos microorganismos productores de gastroenteritis. (2) Patología causada por la producción de toxinas o por enteroinvasividad. (3) El efecto patológico se manifiesta generalmente antes si el microorganismo produce toxinas. (4) Entre los síntomas de gastroenteritis figura siempre la diarrea y sólo en los casos de infección es habitual la fiebre.

OBTENCION DE LA MUESTRA

La obtención de la muestra se hará depositando directamente la misma en un recipiente estéril, frasco de boca ancha. En caso de no ser posible esta toma directa, se recogerá con una cuchara estéril alguna porción del material fecal recién emitido, que no haya entrado en contacto con el frasco receptor (orinal), y se verterá en un contenedor estéril.

El producto así recogido se debe sembrar inmediatamente. En caso de no poder sembrar la muestra «in situ», y ante la necesidad de mandarla a un laboratorio, aunque esté relativamente cercano, es conveniente enviar parte de ella, incluida en algún medio de transporte que mantenga el pH cercano a la neutralidad.
Medio de transporte de Cary-Blair. Es quizá el más aceptado universalmente. Permite incluso la recuperación de anaerobios.

METODOLOGIA 

Observación de la muestra

Al recibir la muestra en el laboratorio se observarán detenidamente sus características, tales como el olor, color, consistencia, o la presencia de mucosidades, sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles pueden orientar algo el diagnóstico; así, por ejemplo, unas heces líquidas con grumos en forma de agua de arroz, harán pensar en el cólera, o la sangre y mucosidades indicarán una sintomatología inflamatoria del intestino, que puede ser debida a una disentería.

Hay autores que completan esta apreciación microscópica, mezclando en un porta una pequeña porción de heces con una gota de azul de metileno, tapándolo con un cubre y observando la preparación con objetivo de inmersión, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotará que hay inflamación en el intestino, la cual suele estar producida por agentes infecciosos invasores como Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en cambio, ante un proceso gastroenterítico, con heces exentas de glóbulos blancos, se sospecha una etiología virásica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli enterotóxico. Incluso hay investigadores que afinan más, y con una técnica de coloración como la de Wright, llegan a establecer las distinciones etiológicas expuestas en la siguiente tabla.

ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES ASOCIADAS CON LEUCOCITOS FECALES
Enfermedad	Porcentaje de pacientes con leucocitosis fecal (1)	Tipo de leucocito predominante (2)
Shigelosis	100	Leucocitos polimorfonucleares (media 84 %).
Salmonelosis (no por S. typhi)	82	Leucocitos polimorfonucleares (media 75 %).
Fiebre tifoidea	100	Leucocitos mononucleares (media 95 %)
E. coli (invasor)	100	Leucocitos polimorfonucleares (media 85 %).
Colitis ulcerosa (activa)	100	Leucocitos polimorfonucleares (media 88%) (eosinófilos, media 8 %).
Disentería amebiana (activa)	Variable	Por lo general mononucleares, salvo infección bacteriana secundaria
Controles sanos, diarrea virásica, cólera.	0-10
(1) La leucocitosis fecal se puede apreciar, simplemente, por observación entre porta y cubre. (2) El tipo de leucocitos se observa después de una coloración de Gram.

Conviene recordar la poca utilidad de las coloraciones diferenciales directas (Gram), sobre el material fecal. En caso de tenerlo, su valor queda restringido al diagnóstico de afecciones levaduriformes del género Candida , o al de infecciones estafilocócicas, que sobrevienen después de largos tratamientos con antibióticos de amplio espectro.

No son del todo valorables los resultados obtenidos con técnicas de inmunofluorescencia, pues los distintos géneros de Enterobacteriaceae presentan bastantes antígenos comunes.
Estudio de los distintos patógenos
Los microorganismos citados como patógenos se pueden separar en cuatro grupos muy diferenciados desde el punto de vista morfológico: virus, protozoos, levaduras y bacterias.

Virus : De las técnicas de diagnóstico virológico, sólo están al alcance de la mayoría de los laboratorios, las indirectas, es decir, las serológicas y aun no todas; las directas están reservadas a laboratorios altamente especializados. Entre las primeras podemos citar las de inmunofluorescencia indirecta, ELISA, y fijación de complemento. Entre las directas, los cultivos en líneas celulares y sobre todo la observación al microscopio electrónico (ME). Esta última permite con un máximo de eficacia, entre el segundo y tercer día de establecida la gastroenteritis, detectar el número, estado y frecuencia de los virus.

El principal agente virásico productor de infecciones gastrointestinales es el Rotavirus. actualmente se puede hacers por microscopía de fluorescencia.  Es una técnica utilizada en casos muy concretos, en los que además se quiere investigar la presencia de otros microorganismos raros o difíciles, los laboratorios deberán seleccionar estas muestras y enviarlas a laboratorios especializados, o a los de referencia como el Centro Nacional de Microbiología de Majadahonda. La forma correcta de hacerlo sería mandar unos 10 g. de material fecal en recipiente estéril y protegidos a 4° C.

Protozoos : Igual que para el estudio bacteriológico, las muestras han de ser recientes y se deben procesar recién llegadas al laboratorio. En el caso de no poderlas estudiar en seguida, se les añadirá alguna sustancia que mantenga la morfología de las formas trofozoicas. Para este propósito es útil el alcohol polivinílico. Un estudio parasitológico incluye tres tipos de técnicas:

a) Observación en fresco con lugol para quistes, o con solución salina para trofozoitos.

b) Coloraciones (hematoxilina férrica, etcétera). 

c) Concentración de quistes.

Levaduras : Las levaduras, por sus características de cultivo y propiedades fisiológicas, se incluyen dentro de la sistemática de estudio de las bacterias.

Bacterias : Las bacterias son, si no el grupo más numeroso de agentes etiológicos de gastroenteritis, por lo menos el más conocido.

Para su reconocimiento no se precisan técnicas tan especializadas como para los virus, ni la observación morfológica como para los protozoos, sino el crecimiento en medios de cultivo, y una posterior identificación por medio de pruebas bioquímicas, serológicas.

Siembra de muestras para bacteriología

Para hacer el coprocultivo, es decir, la siembra de las muestras fecales, se recogerán aquellas partes del contenido intestinal que llamen más la atención por su aspecto sanguinolento o mucoso, pues es allí donde abundan los microorganismos patógenos.

La inoculación se efectuará sobre medios de cultivo propios y selectivos de los principales patógenos intestinales, incluyendo, dada su importancia, un medio de enriquecimiento para Salmonella (selenito o tetrationato). Las cepas de Salmonella aisladas se identificarán por pruebas bioquímicas y se confirmará su identidad mediante un polivalente serológico. No es necesario que los pequeños laboratorios dispongan de todo el amplio material perecedero para serotipificar a Salmonella. La presencia de Shigella también se confirmará serológicamente.

Es discutible la inclusión rutinaria de métodos y medios para el diagnóstico de Vibrio cholerae y Campylobacter. El primero porque es poco frecuente y además porque las características clínicas del paciente y las de la muestra ya orientarían hacia ello en caso necesario. Se valora la muestra, concediendo especial importancia a la edad del paciente y a la consistencia del producto.

CARACTERISTICAS DE BACTERIAS PATOGENAS

A continuación se precisan algunas características clínicas y de cultivo de las bacterias reconocidas como enteropatógenas y se discuten las de alguna cuya etiología es dudosa.

Salmonella : Las últimas tendencias en taxonomía aceptan el establecimiento de una sola especie de Salmonella. Le Minor, en la última edición de «EI Manual de Bergey» (1984), propone como única especie a Salmonella choleraesuis subdividida en seis subespecies.

En el XIV Congreso Internacional de Microbiología celebrado en Manchester (1986), el Comité Internacional de Sistemática Bacteriana a través del Subcomité Internacional de Enterobacteriaceae , ha decidido modificar el nombre de Salmonella choleraesuis , propuesto por Le Minor, por el de Salmonella enterica , quedando los gérmenes conocidos tradicionalmente como S. enteritidis , S. typhimurium, S. dublin, etc., en la categoría de serotipo, biotipo o bioserotipo dentro de su correspondiente subespecie (datos facilitados por el doctor Usera. Majadahonda).

De forma general se podría decir que la Salmonella produce dos cuadros clínicos muy diferenciados, y que en ambos casos puede hacerse el diagnóstico a partir del coprocultivo.

Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero está producido por Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo está causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis,Salmonella Choleraesuis, etc. En contra de esta clara diferenciación, aceptada por todos, hay autores que señalan que pierde valor cuando se trata de niños, y que en ellos cualquier Salmonella puede producir los dos síndromes.

El diagnóstico de la fiebre tifoidea puede hacerse por métodos directos y por métodos indirectos. Los primeros son aquéllos que permiten aislar el microorganismo, como son: el hemocultivo y el coprocultivo. Aveces, aunque es raro, se puede aislar también el germen de la orina.

Los métodos indirectos son aquellos que ponen de manifiesto la acción del germen sobre el organismo, es decir, demuestran la presencia de anticuerpos específicos contra el agente etiológico.

– El hemocultivo presenta un máximo de positividad durante la primera semana. – El coprocultivo permite aislar con un 30-50 por 100 de posibilidad Salmonella durante todo el transcurso de la enfermedad, siempre y cuando el paciente no esté bajo tratamiento.

Para aislar Salmonella, las siembras de las heces se efectuarán sobre medios de enriquecimiento selenito de Leifson, y al mismo tiempo sobre medios selectivos como el Hektoen resembrando a las doce-dieciséis horas de incubación un asa de las primeras en una placa de estos últimos. Con las colonias sospechosas se realizarán pruebas de identificación.

En el otro síndrome clínico, es decir, la infección gastrointestinal, el coprocultivo es a menudo el único método que permite demostrar la etiología.

El hemocultivo es sólo efectivo en algunas ocasiones.

Shigella : Existen cuatro grupos de Shigella, representados respectivamente por Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, y Sh. boydii.
La Shigella es un germen muy lábil y que resiste muy poco tiempo en las heces del organismo humano, a esto se debe la necesidad de sembrar lo antes posible las muestras sospechosas de contener Shigella.
El medio de cultivo más utilizado es el selectivo llamado SS, o Salmonella-Shigella, que se siembra con ún inóculo abundante.

La Shigella es productora de la disentería bacteriana, y de muchas colitis en verano. A pesar de ser la responsable de las citadas enfermedades, en la actualidad la tendencia es no tratar las infecciones debidas a este microorganismo. En España no es frecuente la Sh. dysenteriae, siendo la más común Sh. sonnei.

Vibrio : Hay varias especies del género Vibrio que son responsables de distorsiones intestinales. La más importante, Vibrio cholerae, produce su efecto gracias a una toxina muy semejante a la del E. coli enteropatógeno. En los casos típicos, las heces presentan un aspecto conocido como agua de arroz, debido a su color blanco y consistencia líquida, con grumos que contienen gran cantidad de pequeños bacilos gramnegativos ligeramente curvados.

El aislamiento de las heces se hace utilizando medios selectivos, como el agua de peptona alcalina (pH 8,4), o el de Nakanishi modificado o TCBS, a base de tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa.

Otros vibrios semejantes al Vibrio cholerae, como su biotipo El Tor, y los vibrios NAG o no aglutinables, fabrican de igual forma la citada enterotoxina, poseyendo estos últimos también un cierto efecto invasor del tejido intestinal.

Si los vibrios NAG se encuentran principalmente en aguas dulces, el Vibrio parahaemolyticus vive en el agua del mar, dándose cada vez con mayor frecuencia cuadros de gastroenteritis transmitidos a partir de los llamados frutos del mar (mariscos y pescados poco cocidos).

Yersinia : Es otro miembro de la familia Enterobacteriaceae que suele producir trastornos intestinales. De sus tres especies, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis, sólo las dos primeras están implicadas en los citados procesos, especialmente la inicial.

La Yersinia enterocolitica produce gastroenteritis aguda, caracterizada por diarrea líquida.
La Yersinia enterocolitica crece bien en medios ordinarios como el agar SS o el agar desoxicolato. Aunque las colonias aparecen a las cuarenta y ocho-setenta y dos horas, su pequeñez y poca proporción en ocasiones les hace pasar desapercibidas. Para facilitar su aislamiento se utilizan medios selectivo 4º C durante tres semanas en selenito o BHI. Lógicamente, los diagnósticos hechos con estos procesos de enriquecimiento no son válidos para implantar un tratamiento clínico, pero sí para estudios epidemiológicos.

Indirectamente puede hacerse el diagnóstico enfrentando suero del paciente con una mezcla polivalente, o, cuando menos, que contenga los serotipos 3 y 9. Títulos iguales o superiores a 1/160 son significativos.
Escherichia coli : Gracias a los trabajos empezados por Kauffmann, y sobre la base de 157 antígenos somáticos (0), 93 capsulares (K) y 52 flagelares (H) de los que hay tres variedades (L, A y B), es posible identificar serológicamente a E. coli.

Esta determinación serológica, en la práctica diaria de los laboratorios de microbiología, sólo se realiza para la investigación de una serie de Escherichia denominados enteropatógenos, y cuya patología parece reducirse a gastroenteritis infantiles en niños menores de dos años y medio.

Ahora bien, en la actualidad se duda de su verdadera intervención, pues es posible aislarlos de muchas heces infantiles que no tienen síntomas de gastroenteritis. En casos aislados sólo podremos imputarle con seguridad la etiología del proceso si comprobamos su capacidad enteropatogénica. E. coli enteropatógeno puede efectuar de dos maneras su acción intestinal, una produciendo enterotoxinas, de las cuales se conocen dos (ST o estable al calor y LT o lábil al calor, que es parecida antigénicamente a la enterotoxina de V. cholerae ) y otra por la invasión de las células epiteliales del intestino, produciendo un cuadro disenteriforme, denominándose respectivamente E. coli enterotoxigénico y E. coli enteroinvasivo.

Anaerobios esporulados : Los anaerobios esporulados no suelen producir infecciones gastrointestinales, y sólo se cita con escasa frecuencia la presencia de Clostridium perfringens causante de intoxicaciones alimentarias. También se han mencionado casos de colitis pseudomembranosa debidos a Clostridium difficile.

Otros microorganismos que con menor frecuencia se consideran responsables de gastroenteritis son los siguientes:

Candida : sobre todo Candida albicans, que es aislada mayoritariamente de heces patológicas de niños pequeños. En ocasiones es posible su hallazgo en el contenido fecal de adultos con trastornos intestinales recién llegados de patses del Medio y Lejano Oriente.
Pseudomonas : Frecuente en personas tratadas largo tiempo con antibióticos de amplio espectro.

Staphylococcus aureus : Su presencia es favorecida también por terapia con antibióticos de amplio espectro. Además de este efecto por sobrecrecimiento, son muy frecuentes las intoxicaciones alimentarias por la enterotoxina, producida por el microorganismo.

Campylobacter : Desde hace algún tiempo se reconoce a Campylobacter jejuni como el patógeno intestinal con mayor morbilidad. Generalmente afecta a niños pequeños, a los que produce diarrea y a veces vómitos
La fuente de infección suele ser el agua, o, más frecuentemente, los alimentos de origen animal. También se encuentra en abundancia en las heces de animales domésticos.

El desarrollo de su patología no está bien definido, ya que mientras que, por un lado, produce manifestaciones enteroinvasivas (con producción de sangre y leucocitos), por otro, hay constancia de que libera una enterotoxina similar a la de Vibrio cholerae y E. coli enterotoxigénico.

Para el diagnóstico microbiológico, la siembra de las heces debe hacerse muy rápidamente, preferiblemente antes de dos horas. En caso de no ser posible, se incluirá la muestra en un medio de transporte adecuado (el mejor es el de Cary-Blair).

Para el cultivo de Campylobacter se precisan unas condiciones especiales, que son: disponer de un medio selectivo, temperatura de incubación de 42-43° C y atmósfera microaerofílica (reducida de oxígeno) con C02.

Hay varios medios de cultivo selectivos apropiados, la mayoría de ellos comercializados, como el Skirrow, el Butzler o el Campy BAP, no siendo necesario utilizar ningún medio de enriquecimiento previo.

La incubación a 42-43° C se realiza por espacio de cuarenta y ocho-setenta y dos horas en una atmósfera que contiene un 5 por 100 de 02, 10 por 100 de C02 y 85 por 100 de N2.
Con las colonias sospechosas crecidas en los medios antes mencionados, se efectúa una identificación presuntiva, observando su morfología bacilar gramnegativa en espiral (es mejor usar como colorante de contraste fucsina fenicada al 0,3 por 100), su movilidad característica y la capacidad de dar positiva la prueba de la oxidasa.

Se puede completar la determinación con una batería de pruebas bioquímicas, de las cuales destacamos la catalasa, la reducción de nitratos, la producción de SH2 y la hidrólisis del hipurato.

Aeromonas : Aeromonas hydrophila se aísla con relativa frecuencia de heces diarreicas, habiéndose comprobado su capacidad enterotóxica y enteroinvasiva.
Otros enteropatógenos son  Streptococcus faecalis variedad , que produce toxiinfección, y Bacillus cereus, que da lugar a intoxicaciones.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Generalmente se admiten tres matizaciones para definir el resultado de un estudio microbiológico intestinal:

a) Presencia de gérmenes enteropatógenos. 

b) Ausencia de gérmenes enteropatógenos. 

c) Disbacteriosis intestinal.


El tercer apartado podría ser más discutible. Se entiende por disbacteriosis la presencia mayoritaria de un tipo de microorganismo que generalmente está en poca o inapreciable proporción. Dicho de otra forma, cualquier tipo de microorganismo distinto de E. coli que crezca en abundancia en un medio diferencial para Enterobacteriaceae, como, por ejemplo, el EMB.

Esputo:protocolo de rutina

Estudio microbiológico del esputo y vías respiratorias inferiores 

INTRODUCCION 

El esputo es una sustancia que está constituida por materia procedente de las vías respiratorias inferiores, que llega a la boca gracias a fenómenos de expectoración. El hecho de tener que realizar un largo recorrido desde que se produce hasta que sale al exterior, condiciona que arrastre consigo a restos celulares y a microorganismos que se encuentran a su paso, falsificando o enmascarando el producto inicial.
Sin embargo, hay varios procesos bacterianos que actualmente aún se investigan en esputo: la neumonía bacteriana, la bronquitis crónica y la tuberculosis pulmonar.

Los microorganismos que con mayor frecuencia se encuentran complicados en estas afecciones respiratorias son: Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus, que muchas veces causan neumonías mucho más rápidas y peligrosas que el propio neumococo;Enterobacteriaceae, sobre todo coliformes y Proteus, Pseudomonas y Haemophilus influenzae.

También son motivo de infecciones Mycoplasma pneumoniae, Histoplasma capsulatum y Mycobacterium tuberculosis. Con excepción de estos tres últimos, los anteriores forman parte en cierta manera de las vías respiratorias superiores, y, por tanto, pueden recuperarse de los cultivos sin tener importancia patológica. El microbiólogo debe saber valorar la presencia de estos microorganismos, teniendo en cuenta que en neumonías bacterianas agudas, el germen responsable suele encontrarse casi en cultivo puro.

OBTENCION DE LA MUESTRA 

Para que la recogida de esputo sea aceptable, deberá cumplir una serie de requisitos, resumidos a continuación:

— El material se recogerá en un frasco estéril de boca ancha.

—Se procurará que la expectoración se efectúe a primera hora de la mañana, y que provenga de tos profunda (esputo traqueobronquial).

Se desecharán las muestras con saliva, o con moco de procedencia nasal (muestras inadecuadas).

La muestra se procesará enseguida, sobre todo si se sospecha histoplasmosis. Como máximo puede guardarse varias horas en nevera (una-tres horas).

METODOLOGIA 

A partir de la muestra se efectuará un frotis, procurando extender las partes más purulentas del esputo, que se teñirán por el método de Gram. Si el clínico lo solicita, se practicará también una tinción para Mycobacterium (Ziehl-Neelsen o auramina)
La coloración de Gram permite visualizar la flora bacteriana del esputo, observándose diplococos lanceolados grampositivos junto a células de pus, típico de neumococos, o abundantes racimos de cocos grampositivos, característicos del estafilococo, o numerosos bacilos cortos y gruesos, gramnegativos, a veces capsulados, significativo de Klebsiella pneumoniae, cuya infección debe tratarse inmediatamente, pues su evolución es rápida y fatal. En cualquiera de los casos, y sin esperar el resultado de los cultivos, se indicará al clínico la etiología sospechosa para que tome las medidas oportunas.

Investigación de neumonía por neumococo 

Actualmente, en el medio extrahospitalario, el 70-80 por 100 de las neumonías bacterianas siguen siendo de etiología neumocócica. En el medio nosocomial van aumentando progresivamente las debidas a bacterias gramnegativas. En ambos casos, los principales métodos microbiológicos lo constituyen el hemocultivo y el análisis de esputo.

Son sospechosos de neumonía aquellos esputos de apariencia rojiza (herrumbrosos), o manchados de sangre (hemoptoicos). En estos casos se procederá de la siguiente forma:

a) Se seleccionarán los grumos purulentos o los filamentos sanguinolentos de la muestra, y, con la ayuda de un asa de platino, se depositarán sobre un portaobjetos. A continuación se tapará con un cubre y se apretarán los dos cristales con el fin de obtener una extensión fina. Se fijará por calor y se teñirá por el método de Gram. Con la diferencia de la técnica de tinción, este mismo método se utiliza para preparar frotis para investigar Mycobacterium tuberculosis.

b) Se sembrará una porción purulenta o sanguinopurulenta sobre agar sangre 5 por 100 de carnero, y se incubará en atmósfera de C02 a 37° C durante veinticuatro horas. Algunos autores siembran otra porción de la muestra en tioglicolato, que actúa como medio de enriquecimiento, y al día siguiente resiembran en agar sangre 5 por 100 de carnero.

c) Después de las oportunas incubaciones, en caso de que existan neumococos, aparecerán en forma de colonias planas, brillantes, alfa-hemolíticas, transparentes, y con el centro deprimido y los bordes más altos. Entre las pruebas necesarias para su identificación destacan la solubilidad en bilis y la sensibilidad a la optoquina. También pueden identificarse serológicamente.

Investigación de neumonía por otros microorganismos patógenos

Las características del esputo pueden orientar algo sobre el microorganismo que está presente en él. Así los esputos espesos y consistentes pueden ser debidos a Klebsiella pneumoniae, y los purulentos de olor fétido a microorganismos anaerobios en pacientes con abscesos pulmonares, empiemas o bronquiectasia.
Otros gérmenes que con frecuencia producen infecciones pulmonares son Escherichia coli y otras Enterobacteriáceas, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, los cuales, al igual que Klebsiella pneumoniae, crecen bien en agar sangre y no presentan dificultad en su identificación.

En ocasiones pueden pasar desapercibidas las infecciones fúngicas, responsables de cuadros como histoplasmosis, criptococosis, candidiasis, etc. Es de gran ayuda en su descubrimiento, la simple observación en fresco de la muestra.

Del resto de posibles agentes de infecciones pulmonares, cabe destacar al parásito oportunista Pneumocystis carinii, que para su diagnóstico precisa de técnicas no microbiológicas, como son la biopsia pulmonar teñida con sales de plata (Gomorri).

NEUMONIAS ATIPICAS: 

Hay pulmonías que cursan clínica y radiológicamente de forma distinta a la clásica neumonía de Streptococcus pneumoniae. A estos procesos, se las denomina neumonías atípicas, y están producidas por microorganismos que difícilmente pueden investigarse por metodos directos, por lo que se han desarrollado una serie de pruebas serológicas para tal efecto.
A continuación se describen las características de estos microorganismos, prestando especial atención a alguno de ellos.

Virus . Son probablemente los microorganismos que antes desaparecen de las secreciones pulmonares, por lo que su investigación debe efectuarse muy tempranamente. Entre los métodos de diagnóstico serológico destacan la contrainmunoelectroforesis y el enzimoinmunoensayo (ELISA). La reacción de fijación de completo es también muy utilizada para la investigación de virus respiratorios.

Mycoplasma pneumoniae . Es el productor de la neumonía atípica primaria. Es el microorganismo de vida libre más pequeño que existe. Sus dimensiones están próximas al poder resolutivo del microscopio óptico. El pequeño tamaño de sus elementos cocoides (0,1-0,3 micras), les capacita, al igual que a muchos virus, para atravesar los filtros de membrana, hecho que en principio abogó por su unión. Actualmente se les considera incluidos dentro del grupo de las bacterias por poseer dos ácidos nucleicos y crecer in vitro en medios de cultivo análogos a los utilizados por ellas. Presentan la particularidad de estar exentos de pared celular durante toda su vida.

Cultivados en medios sólidos, las colonias de Mycoplasma suelen tener una forma característica, que recuerda a un «huevo frito», debido a la formación de un cuerpo central que penetra en el agar, rodeado de un área circular que al ser más delgada despide una tonalidad más clara. Normalmente los medios líquidos inoculados pueden parecer estériles, debido a que el pequeño tamaño de las células evita que la luz se difracte, atravesando el tubo sin manifestar turbidez.

El Mycoplasma pneumoniae, produce infección al atacar las membranas celulares epiteliales de las vías respiratorias. El período de incubación es de dos a tres semanas y no hay signos de enfermedad.

La mejor forma de efectuar el diagnóstico de la neumonía atípica primaria es por fijación de complemento, cuyos anticuerpos se manifestan a los siete-diez días del comienzo del cuadro clínico. Con frecuencia aparecen aglutininas frías (anticuerpos IgM), que son los primeros detectados, aunque su desarrollo no es específico. De todas formas, una clínica respiratoria con aumento de crioaglutininas policlonales, es muy sugestivo de la enfermedad.

Los métodos directos de diagnóstico no son útiles para investigar una etiología micoplásmica de la neumonía atípica, pues el microorganismo tarda casi un mes en desarrollar sus colonias sobre el medio de cultivo. De todas formas, a continuación se detallan sus principales características morfológicas, de cultivo e investigación.

La toma de muestra se efectúa de las superficies mucosas, por las que posee una especial predilección (cavidad oral), y del tracto respiratorio (esputos, gargarismos, etcétera).

El medio de cultivo utilizado consta de 70 por 100 de caldo PPLO, 2O por 100 de suero de caballo o de cerdo y 10 por 100 de extracto de levadura fresca, preparada al 25-50 por 100. Para solidificarlo se añade 1 por 100 de ion-agar al caldo. Como antibacterianos se añade penicilina G (1.000.000 UI) y 2 ml. de acetato de talio al 2,5 por 100. Este medio expuesto sirve para el crecimiento de Mycoplasma, pero es suceptible de variaciones, igualmente válidas.

El pH de crecimiento es de 7,8-8. Para ajustarlo se recomienda utilizar bicarbonato al 4,4 por 100 o P04 K2 H 1 molar en lugar de OHNa, ya que éste precipita al suero y enturbia al conjunto. Las principales variaciones del medio básico son:

a) Medio líquido con glucosa: Consta del medio líquido básico al que se añade 2 ml. de rojo fenol al 0,1 por 100 y 1 ml. de glucosa al 10 por 100. Se ajusta a pH 7,8-8, con lo que adquiere un color rojo púrpura. El crecimiento de los organismos fermentadores de la glucosa (Mycoplasma pneumoniae) se pone de manifiesto por un gradual cambio de color hacia el amarillo.

b) Medio líquido con arginina: Está constituido por el medio básico al que se añaden 2 ml. de rojo fenol al 0,1 por 100 y 1 ml. de arginina al 10 por 100. Se ajusta el pH a 7, añadiendo 0,2-0,4 ml. de HCI N. El color final del medio es amarillo anaranjado, y los microorganismos que metabolizan la arginina (otros micoplasmas distintos a Mycoplasma pneumoniae) producen un cambio de color a rojo (aumentan el pH).

c) Medio con azul de metileno: Se utiliza normalmente en forma difásica. Consta del medio básico con glucosa al que se añade 1-1,5 ml. de azul de metileno al 0,1 por 100 y se ajusta el pH a 7,8. Mycoplasma pneumoniae es la única especie capaz de crecer en este medio y reducir el azul de metileno, al tiempo que fermenta la glucosa, variando el color de azul oscuro a verde intenso.

Las muestras clínicas procedentes de la cavidad oral se inoculan en el medio básico sólido y en los tres caldos, produciendo a los veinticinco-treinta días las diminutas y características colonias (apreciables con 15 aumentos), y variando la coloración de los caldos, a) y c).

Con frecuencia los micoplasmas recién aislados no forman colonias con centro, sino simplemente circulares. Posteriormente, cuando el microorganismo se adapta al medio de cultivo de laboratorio, se produce la típica forma colonial. Otras veces, las colonias aparecen como formas rugosas o granulares de superficie irregular, que sobresalen algo del agar e indican crecimiento bacteriano. Para comprobar que este crecimiento es debido a Mycoplasma pneumoniae, se selecciona una de estas colonias al microscopio y con una espátula estéril se corta el bloque de agar que la contenga, y se deposita sobre otro medio para micoplasmas, de modo que la pseudocolonia contacte con la superficie del nuevo agar. A continuación, presionando ligeramente, se desplaza el bloque en todas direcciones. Esta nueva placa se incuba en las condiciones antes mencionadas, y se inspecciona periódicamente al microscopio, intentado descubrir la presencia de microcolonias.

Nunca se debe efectuar la resiembra de una colonia de Mycoplasma con asa, pues no se conseguirá, o si se logra, significa que se trata de una contaminación.

Legionella pneumophila es el agente causal de una neumonía atípica denominada enfermedad de los legionarios.

Los sucesos acaecidos condicionaron que al cuadro neumónico, de etiología desconocida, se le llamase enfermedad de los legionarios. Posteriormente se consiguió aislar la bacteria, denominándola Legionella pneumophila, de la que en la actualidad se conocen varios serogrupos.

Es curioso mencionar que ya en 1947 se había cultivado la bacteria, pero sin concederle una importancia clínica concreta.

En el esfuerzo de los científicos por incrementar los conocimientos sobre el germen, se aislaron cepas de microorganismos íntimamente relacionados con él, que en primer lugar se designaron como «organismos semejantes a Legionella » pero que después han constituido nuevas especies. Entre ellas podemos destacar a L bozemanii, L dumoffii, L micdadei y L gormanii.

Legionella pneumophila es un bacilo gramnegativo de 0,5 a 0,7 micras de anchura por 2 micras de largo, aunque puede llegar a tener hasta 20 micras. Para su visualización en cortes de tejido se utilizan técnicas de impregnación argéntica, recomendándose preferentemente la modificación de Dieterle.

Es móvil por un flagelo polar y uno lateral poseyendo además otros apéndices parecidos. Es muy poco activa bioquímicamente. No es esporulada y produce catalasa y oxidasa, esta última a veces, débilmente. También fabrica gelatinasa y beta-lactamasas.

Estudiando al microorganismo por cromatografía de gas-líquido se ha comprobado que está constituido por gran cantidad de ácidos grasos de cadena ramificada, lo cual representa una característica taxonómica de especial interes.

Crece muy lentamente en medios de cultivo enriquecidos como el agar Charcoal Yeast extract o el agar Feeley-Gorman. Otro medio en el que se obtienen buenos resultados es el MH-IH. Existe también la modificación de Smalley y cols. que han propuesto añadir selenito sódico al agar Feeley-Gorman, señalando que se favorece el crecimiento de Legionella.

Estos medios no selectivos —el único que lo es algo es el suplementado con selenito— son aptos para el aislamiento del microorganismo a partir de muestras líquidas no contaminadas, como líquidos pleurales o aspirados transtraqueales. Si el estudio se efectúa sobre productos contaminados (esputos, etc.), es más recomendable utilizar medios semiselectivos, como el de Edelstein y Finegold.

La incubación se realiza a 35° C en aerobiosis, exceptuando en el medio de Feeley-Gorman, en que se aconseja añadir un 2,5 por 100 de C02, y en el MH-IH donde es recomendable hacerlo en un frasco bujía.

Las colonias de Legionella tardan varios días en crecer y son muy pequeñas. Las que lo hacen en el medio de Feeley-Gorman suelen presentar una pigmentación gris. En cuanto a la supervivencia, hay autores que aseguran que Legionella pneumophila es capaz de permanecer viable por espacio de dos meses en agar Charcoal
Para aislar al microorganismo también resulta útil la inoculación al cobaya.

Para confirmar la identificación se utilizan técnicas de fluorescencia directa, cromatografía gas-líquido, o métodos genéticos de hibridación de ácidos desoxirribonucleicos.

Las técnicas de fluorescencia directa pueden utilizarse a su vez, con aceptables niveles de sensibilidad, sobre secreciones respiratorias, líquidos pleurales, aspirados transtraqueales o esputos.

El diagnóstico de la enfermedad puede hacerse también por métodos serológicos, buscando anticuerpos específicos en el suero del paciente, que presenta títulos ascendentes a partir de la primera semana y con un máximo hacia la quinta. La investigación se hace por microaglutinación o por ELISA, aunque la técnica universalmente aceptada es la de inmunofluorescencia indirecta.

Parece ser que la sintomatología neumónica que motivó el interés por la enfermedad, sólo es un aspecto, quizá el más importante, de las manifestaciones clínicas de la infección. En otros casos afecta a los sistemas renal, gastrointestinal o nervioso central.

Hasta el momento no se conoce ningún reservorio del microorganismo ni el mecanismo de transmisión; sin embargo, la vía más probable parece ser la aérea, penetrando mediante la respiración.